表达与临床特征及术后复发的相关性研究\"黄 刚」，陈 霏？，肇玉博［，张 迪」(1.陕西中医药大学附属医院检验科，
陕西咸阳712000E.陕西省核工业二一五医院检验科，陕西咸阳712000)摘 要：目的 探讨血浆微小RNA(microRNA, miRNA)-145和miRNA-221表达在非小细胞肺癌(non-small cell lung
cancer,NSCLC)术后复发中的诊断价值。方法 选取2016年4月~2018年4月期间在陕西中医药大学附属医院和陕西
省核工业二一五医院胸外科行手术切除的55例原发性非小细胞肺癌患者的临床资料进行回顾性分析，依据术后是否复发 分为复发组和未复发组.同时选取50例同期体检健康者作为对照组.采用实时聚合酶联反应(real-time polymerase chain
reaction,R^-PCR)技术检测NSCLC患者血浆miRNA-145和miRNA-221的表达，采用电化学发光方法检测血清细胞角 蛋白片断21-1(CYFRA21-1)和癌胚抗原(CEA)水平，比较分析以上标志物的变化与NSCLC患者术后复发的关系。结果 在对照组、未复发组和复发组中，血浆miRNA-145和miRNA-221的表达分别为0. 97 + 0. 27,0. 35土0. 15,0. 17 + 0. 09
和0. 20土0. 11,0. 39土0. 17,1. 06土0. 31 未复发组的miRNA-221表达显著高于对照组，而显著低于复发组；未复发组的
miRNA-145表达显著低于对照组，而显著高于复发组；以上比较的差异均有统计学意义(F=11& 73~123. 72,均P < 0. 01) 在对照组、未复发组和复发组中，血清CYFRA21-1(ng/ml)和CEA (ng/ml)水平分别为3. 02土1. 17,0. 05土3. 43,
47. 68土16. 72和2. 31土2. 03,7. 37土3. 29,29. 37土12. 49。复发组和未复发组的CYFRA21-1和CEA水平与对照组比较
显著增高；复发组两肿瘤标志物水平与未复发组比较显著增高；以上比较差异均有统计学意义(F =87.46~96.83,均P<
0. 01) 在复发组中，血浆miRNA-145和miRNA-221表达具有负相关性(代=0. 772,<0. 01) miRNA-145表达分别与
CYFRA21-1 和 CEA 水平有负相关性((=0. 772~0. 794,均 PV0.01),而 miRNA-221 表达分别与 CYFRA21-1 和 CEA 水平有正相关性(/ = 0. 663~0. 687,均P<0. 01) 血浆miRNA-221和miRNA-145表达在鳞癌中的异常率高于腺癌，在
TNM-期中的异常率高于”-•期(才=0. 012〜0.039,均P<0. 05)；两标志物与患者年龄、肿瘤大小和吸烟无明显相关性
(=0. 301〜1. 000,均P〉0. 05) 结论 血浆miRNA-145和miRNA-221的差异表达与NSCLC的病变进展有关，检测
血浆miRNA-145和miRNA-221表达可用于监测NSCLC术后的复发。关键词 非小细胞肺癌；微小RNA-145；微小RNA-221；细胞角蛋白片断211(CYFRA211)；癌胚抗原
(CEA)中图分类号：R734. 2；R730. 43 文献标志码：A 文章编号1671-7414(2019)04-040-05doi：10. 3969/j. issn. 1671-7414. 2019. 04. 010Study on the Correlation between the Expression of MicroRNA145 and MicroRNA221 in Plasma and Clinical Characteristics and
Postoperative Recurrence in Patients with Non-Small Cell Lung Cancer
HUANG Gang1 ? CHEN Fei2 ? ZHAO Yu-bo1 , ZHANG DP (1. DwparE祝勿t of C伉加cqZ I^aboratory,Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine University of Shaanxi ^Shaanxi Xianyang
712000, CMna; 2. 215 o于 Nuclear Industry of Shaanxi Xianyang 712000, Ch讪 a)Abstract:Objective To investigate the diagnostic value of the expression of microRNA145 and microRNA221 in plasma for
postoperative recurrence of non-small cell lung cancer (NSCLC). Methods The clinical data of55 patients with primary
NSCLC who underwent surgical resection at the Department of Thoracic Surgery in Affiliated Hospital of Traditional Chi
nese Medicine University of Shaanxi and 215 Hospital of Nuclear Industry of Shaanxi from April 2016 to April 2018 were retrospectively analyzed. According to whether the recurrence after surgery,they were divided into recurrent group and non
recurrent group. At the same time, 50 cases of healthy people in the same period were selected as the control group. Real
time polymerase-linked quantitative (RT-PCR) techniquewas used to detect the expression of miRNA-145 and miRNA-221
in plasma of patients with NSCLC,serum levels of CYFRA21-1 and CEA were detected by electrochemiluminescence meth
od. The relationship between the changes of the above markers and the recurrence of NSCLC patients was comparatively an
alyzed. Results In the control group, non-recurrence group and recurrence group, the expression of plasma microRNA-145and microRNA-221 were 0. 97土0. 27,0. 35 土0. 15,0. 17土0. 09 and 0. 20土0. 11,0. 39 土0. 17,1. 06土 0. 31, respectively. The
expression of miRNA-221 in the non-recurrent group was significantly higher than that in the control group,but significantly*作者简介：黄 冈^(1979-),男，大学本科，主管检验师，研究方向：疾病的基因诊断,E-mail：3436309161@qq. com。
通讯作者：陈 霏(1985-)女，大学本科，主管检验师，研究方向：疾病的基因诊断，E-mail：499337430@qq. com。
现代检验医学杂志 第34卷 第4期 2019年7月 J ModLab Med, Vol. 34 ,No. 4 , July. 201941lower than that in the recurrent group. The expression of miRNA-145 was significantly lower than that in the control group,
and significantly higher than that in the recurrent group. The above differences were statistically significant (F=118. 73〜 123. 72,all PV0. 01). The expression of serum CYFRA21-1 (ng/ml) and CEA (ng/ml) in the control group, non-recur- rence group and recurrence group were 3. 02 + 1. 17, 9. 05 + 3.43,47. 68 土 16. 72and 2. 31 + 2. 03,7. 37 + 3.29,29. 37 土
12. 49 , respectively. Compared with the control group, the levels of CYFRA21-1 and CEA in the recurrent group and non-recurrence group were significantly increased. Compared with the non-recurrence group,the levels of the two tumor indicators
in the recurrent group were significantly increased. The above differenceswere statistically significant (F=87. 46〜96. 83 ,
all PV0. 01). A negative correlationwas showed between plasma expression of miRNA-145 and miRNA-221 ( = 0. 772, P V0. 01). miRNA-145 expression was negatively correlated with the levels of CYFRA21-1 and CEA ( =0. 772〜0. 794,11
PV0. 01) , while miRNA-221 was positively correlated with the levels CYFRA21-1 and CEA ( / = 0. 663〜0. 687, all PV 0. 01). The abnormal rate of the plasma expressions of microRNA-221 and microRNA-145 in squamous cell carcinoma was
higher than that in adenocarcinoma,and in TNM stage Ill was higher than that in stage I〜II (才=0. 012〜0. 039 ,all PV 0. 05). There was no significant correlation between the twomarkers and patient's age,tumor size and smoking ( = 0. 301
〜1. 000,11 P〉0. 05). Conclusion The differential expressions ofmiRNA-145 and miRNA-221 in plasma were related to
the progression of NSCLC. Detection of plasma expressions ofmiRNA-145 and miRNA-221 canbe used to monitor recurrence after NSCLC.Keywords: non-small cell lung cancer； miRNA-145 ； miRNA-221 ；CYFRA21-1；CEA肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶 性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung
试剂盒。荧光定量PCR试剂盒购自北京艾德莱生 物科技公司。采用美国ABIstep one荧光定量
cancer,NSCLC)是其最常见的类型口〕。微小RNA
(microRNA,miRNA)是一种长度为19〜22个核 昔酸的内源性小分子非编码RNA,其作为一类高
PCR 仪。1. 3 方法1.3.1非小细胞肺癌患者完成解剖性肺叶切除： 肺叶切除后进行标准的系统淋巴结清扫，所有入组 患者均为R0切除，达到根治性手术标准。术后病
度保守的非蛋白编码RNA参与基因表达的调 控⑵。本文回顾性分析55例行完全切除术的
NSCLC患者的临床资料，探讨血浆miRNA-145 和miRNA-221表达与NSCLC术后复发的关系。理分期IB期且并发高危因素的患者及•期以上 患者建议辅助化疗3〜4周期，采用含钳类的双药 方案。术后5年之内，每6个月行胸部CT检查。
1材料与方法1. 1 研究对象 选取2016年4月〜2018年4月 期间在陕西中医药大学附属医院和陕西省核工业 二一五医院胸外科行手术切除术的55例原发性非 小细胞肺癌患者的临床资料进行回顾性分析，依据
所有患者每年接受1次上腹部B超，头颅CT或者
MRI及全身骨扫描检查。术后每6个月进行一次
随访，记录患者术后局部复发和转移性复发情况，
包括复发或转移的首发部位，岀现的具体时间。术后复发情况分为复发组和未复发组。复发组36 例，其中男性25例，女性11例，平均年龄57. 1土
总RNA提取采用Trizol法。血浆miRNA-
145 和miRNA-221表达采用RT-PCR技术检测。
血清CYFRA21-1和CEA水平采用罗氏公司的
7.5岁；未复发组19例，其中男性14例，女性5
例，平均年龄58. 2 + 7. 3岁。所取标本均经过病理 学证实，符合卫生部2011年版原发性肺癌诊疗规 范标准⑷。选取同期体检健康者50例作为对照
Elecscy601电化学发光免疫分析技术测定，血清 CYFRA21-1和CEA参考值范围分别为0〜6. 3
ng/ml ,0〜3. 5 ng/ml。1.3.2标本采集与处理：抽取所有研究对象肘静 脉血10 ml,未复发组于术后2周采取，复发组在
组，其中男性30例，女性20例，平均年龄59. 7土
7. 1岁。非小细胞肺癌患者术中、术前均未接受放 疗、化疗及免疫治疗。所有患者均符合完全切手术 指征并接受了完全切除术。三组研究对象的年龄、 性别比较，差异无统计学意义(P〉0. 05)。本研究 已获得陕西中医药大学附属医院和陕西省核工业
CT或者MRI扫描显示有局部复发和转移性复发
时采集，对照组于体检时采集。采取的血液分为两
管，一管置于EDTA抗凝管中，在4°C环境以3 000
r/min的速度离心20 min后,收集血浆,用于检测
二一五医院医学伦理委员会批准，并得到所有患者 或亲属的知情同意。miRNA-145和miRNA-221表达。另一管分离血
清用于检测CEA和CYFRA21-1水平，分离的血 清和血浆于一80°C冰箱冻存备用。1. 2 仪器与试剂 湖南湘怡CTK80离心机、罗 氏公司Elecscy 601全自动电化学发光分析仪。总
1.3.3 RT-PCR：总 RNA 提取采用 Trizol 法。引
物设计采用pfimer5软件，使用实时反应PCR仪RNA提取试剂采用北京先锋生物公司FAST1000
42现代检验医学杂志 第34卷 第4期 2019年7月 J ModLabMed,Vol. 34,No. 4,July. 2019进行扩增反应。U6作为内参照。实时定量PCR
1. 4统计学分析 采用SPSS 22. 00软件进行数 据分析，计量资料以均数士标准差（〒士 s）表示。非 小细胞肺癌的临床特征比较采用卡方检验,miRNA-145 和miRNA-221表达以及CYFRA21-1和
反应体系总体积为20 —l,反应条件：94°C预变性3
min,然后以 94°C20 s,60°C20 s 和 72°C40 s 进行 40个循环，通过2一3 求出miRNA-145和miR-
NA-221的相对表达量。表1miRNAsmiRNA-221miRNAs引物序列引物序列上游 5'-CATCTTCCAGTACAGTGTTGGA-3'下游 5匚CTCATTTGTCGTACGAACAGTG■晋CEA水平的比较采用单因素方差分析和q检验分 析。相关性分析采用Pearson法。以P<0. 05为 差异有统计学意义。2结果2. 1 NSCLC患者血清CYFRA21-1和CEA水平
比较见表2。与对照组比较，复发组和未复发组
miRNA-145上游 5，-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3，下游 5'-GTCCAGTGCCCATTGGCCTAATCT-3'的CYFRA21-1和CEA水平显著增高；而与未复 发组比较，复发组的两肿瘤标志物水平显著增高；
U6上游 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'下游 5'-CGAAGCCCTTGCCATCG3'差异均有统计学意义（均P<0. 01）表2
项目CYFRA21-l(ng/ml)NSCLC患者血清CYFRA21-1和CEA水平比较（£士 s）对照组（=50）3.02土1.172.31土2. 03未复发组（=19）9.05土3.43复发组（=36）47.68土16.72F96.8387.46CEA(ng/ml)7.37土3.2929.37土12.492. 2 NSCLC患者血浆miRNA-145和miRNA- 221表达水平比较 见表3。未复发组的miRNA- 221表达显著高于对照组，而显著低于复发组；未
表3
项目miRNA-145 水平miRNA-221 水平复发组的miRNA-145表达显著低于对照组，而显著高于复发组，差异均有统计学意义（P<0.01）。2. 3相关性分析 肺癌患者术后5年生存率为NSCLC患者血浆miRNA-145和miRNA-221表达水平比较（£士 s）对照组（=50）0.97土0. 270.20土0. 11未复发组（=55）0.35土0.150.39土0.17复发组（=55）0. 17土0.09F12. 72118. 731.06土0.3155.35%。在复发组中血浆miRNA-145和miRNA-221 表达具有负相关性（P<0. 01）,见图1。 miRNA-145表达分别与CYFRA21-1和CEA水 平有负相关性（P<0. 01）,见图2~3,而miRNA-
关性（P<0. 01）,见图4〜5。血浆miRNA-221和
miRNA-145表达在鳞癌中的异常率高于腺癌，在 TNM-期中的异常率高于I〜•期（P<0. 05）, 见表4；两标志物与患者年龄、肿瘤大小和吸烟无 明显相关性（P〉0. 05）。221 表达分别与CYFRA21-1和CEA水平有正相表4
项目<60$60NSCLC患者临床特征分析（％）n2233371835miRNA-145miRNA-221x20.768异常6.172.770.372.2正常31.927.329.7异常63.664.3正常36.4X20.301年龄（岁）35.7肿瘤大小Won67.50.36032.5〉3cm27.820.00.03355.574.245.055.80.0124.525.80.551病理类型鳞癌腺癌8.05.062.5100.00.04320431250.055.0TNM分期I〜•-37.54.216.7026.10.03983.3吸烟是否233273.965.26.70.76931.34.847.51.00062.5现代检验医学杂志 第34卷 第4期 2019年7月 J M^odLab Med, Vol. 34 ,No. 4, July. 201943o o o o O
0.25
0.50
八线性=0.768图1 miRNA-145与miRNA-221相关性分析miRNA-2210.75 1.00 1.2530.00 40.00 50.00 60.00 70.00图3 miRNA-145与CYFRA21-1相关性分析2o
CYFRA211八线性=0.6630o
&GVN3E
8o
O6O
15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00图2 miRNA-145与CEA相关性分析CEA15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00
图4 miRNA-221与CeA相关性分析
CEA中呈现低表达，并且与肿瘤的临床分期紧密相
1.20
o.0 .8.6o
八线性=0.687关⑴。SUI等⑷的研究则印证了外周循环中miR
NA-145 表达在非小细胞肺癌中的作用。他们发 现非小细胞肺癌患者血清miRNA-145的表达明
显低于对照组，且miRNA-145对非小细胞肺癌的 诊断具有良好的敏感度和特异度。本研究采用
RT-PCR技术对55例非小细胞肺癌患者的研究显 示复发组患者血浆miRNA-145的表达显著低于 对照组，进一步的分析显示未复发组血浆miRNA-
40.00
50.00
60.00
70.00O
30.00
图5 miRNA-221与CYFRA21-1相关性分析CYFRA21-1145的表达明显增加。提示miRNA-145的表达上
调可能抑制肿瘤细胞的生长并且促进非小细胞肺 癌治疗的进展。3讨论目前早期非小细胞肺癌的治疗已取得了
很大进展,尤其是IA肿瘤期患者手术切除预后良 好，5年生存率达到83. 9%。但大多数非小细胞肺 癌患者到了晚期才能得到正确的诊断,总生存率很 低⑷，因此早期正确诊断并及时治疗可降低非小细 胞肺癌患者的死亡率。更多的研究显示，外周血中
miRNA-221在非小细胞肺癌中的作用也已被 证实。研究表明miRNA-221在非小细胞肺癌复
发组的异常率为61. 1%,上调miRNA-221表达可
以促进非小细胞肺癌NCIH1299细胞株的生长, 而下调miRNA221表达则导致了这种能力的降
microRNA的差异性表达可以识别多种人类肿瘤。 miRNA-145被证实与前列腺癌、膀胱癌、食管癌、 卵巢癌和肾癌等肿瘤的病理过程有关囚。YE 等⑷研究认为miRNA-145的甲基化程度与非小 细胞肺癌患者的预后直接相关，其在非小细胞肺癌
低囚。王峰等凹分析153例非小细胞肺癌患者的
临床资料发现,miRNA-221表达与患者年龄、临床 分期存在明显相关性。多因素COX回归分析显
示，临床分期和miRNA-221表达是影响患者总生 存期的独立危险因素,miRNA-221的高表达与非
肿瘤组织中的表达水平显著下调。此外,miRNA- 小细胞肺癌患者总生存期的缩短有关。miRNA-
145 已被证实在非小细胞肺癌的鳞癌和腺癌组织221 在NSCLC疗效监测中的应用也被证实。有研
44现代检验医学杂志 第34卷 第4期 2019年7月 J F^od Lab Med, Vol. 34,No. 4,July. 2019究纳入184例非小细胞肺癌患者作为研究对象，分
BD强勇，杨楠，张雷，等.非小细胞肺癌患者血清中miR
析其术后复发情况，结果发现复发组血清miRNA-
NA-145 的表达和意义BD医学研究生学报，2016,29
221表达水平及表达率高于未复发组〔词。本研究 采用RT-PCR技术分析非小细胞肺癌患者的疗效 结果显示非小细胞肺癌术后复发组血浆miRNA-
(1):62-65.QIANG Yong, YANG Nan, ZHANG Lei et al. Ex
pressionserum microRNA145 in patients with nonsmall cell lung cancer and its clinical significanceB].
221表达显著高于对照组，而未复发组miRNA- 221表达则明显降低，提示调节miRNA-221表达
可能影响非小细胞肺癌患者的预后。研究表明非小细胞肺癌患者血清CEA和
Journal of Medical Postgreduates, 2016,29(1) ： 62-65.BD YE Zhiqiang,SHEN Ning,WENG Yiminet al. LowmiR-145 silenced by DNA methylation promotes
NSCLCcell proliferation, migration and invasion by
targeting mucin[JD- CancerBiolTher, 2015 , 16 ( 7 )： 1071-1079.CYSRA21-1水平明显增高，且随非小细胞肺癌病
理TNM分期的递增而逐渐增高m。检测血清
CEA和CYSRA21-1水平可以监测非小细胞肺癌
术后的复发「⑴。本研究结果显示未复发组CEA 和CYSRA211水平高于对照组，而低于复发组。 这些结果印证了非小细胞肺癌根治术的疗效，同时 又能提示非小细胞肺癌的复发。相关性分析显示
BD 张潍，张伟，王辉，等.miRNA141 miRNA-145在非
小细胞肺癌中的表达及与临床病理的关系BD・西安 交通大学学报(医学版)2015,36(3) = 368-372.ZHANG Ws% ZHANG Ws% WANG Hui et al. Ex
pression of miRNA141and miRNA145 in non-small cell lung cancer, andtheir relation with clinical pa
复发组血浆miRNA-145和miRNA-221表达分别
thology [J ].Journal of Xi'an Jiaotong University
(Medical Sciences) , 2015,36(3) : 368-372.与CEA和CYSRA211具有显著相关性。非小细
胞肺癌患者病理特征的分析显示miRNA-145和 BD 吴展陵，钟敏华.MicoRNA-221对非小细胞肺癌
NCI-H1299细胞生长的影响及其机制研究BD.解放
miRNA-221表达与TNM分期和病理类型有显著 相关性。以上提示miRNA-145和miRNA-221可
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能参与非小细胞肺癌的病变进展，两标志物的差异
表达可提示非小细胞肺癌术后的复发状况。总之，随着对非小细胞肺癌分子生物学研究的
221 on NCI-H1299 cells growth in non-small-cell
lungcancerBD. Medical hPharmaceutical Journal of
深入，基于肿瘤标志物的诊断及预后研究将会有着
Chinese People? sLiberation Army, 2016,28(6)： 3640.BD王峰，李梅，朱建伟，等.miRNA-221在行完全切除术
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