窑论著窑中国当代医药2018年9月第25卷第27期内皮抑素30肽对HepG2细胞增殖活性和黏附能力的影响于佳琪1赵航1杨扬1魏欣鹏1牛淑冬2李淑艳3银161006161006曰1.齐齐哈尔医学院基础学院袁黑龙江齐齐哈尔3.齐齐哈尔医学院生物化学教研室袁黑龙江齐齐哈尔161006曰2.齐齐哈尔医学院生理学教研室袁黑龙江齐齐哈尔[摘要]目的探讨内皮抑素30肽对肝癌HepG2细胞增殖活性和黏附能力的影响遥方法将内皮抑素氨基端的1耀31位氨基酸渊将25耀31位序列由RGIRGAD改为RGDRGD冤对应的核苷酸序列连接到质粒pTYB2中袁再转化至大肠埃希菌BL21渊DE3冤中表达袁合成由30个氨基酸构成的30肽遥结果HepG2细胞经0尧20尧40尧60尧80尧100滋g/ml的30肽分别处理24尧48h后袁细胞的增殖活性和黏附能力均被抑制袁呈时间剂量依赖性袁与对照组比较袁差异有统计学意义渊P<0.05冤遥结论内皮抑素30肽能有效抑制HepG2细胞的增殖和黏附袁在临床上有望成为肝癌的辅助治疗手段之一遥[关键词]内皮抑素曰增殖曰黏附曰肝癌[中图分类号]R735.7[文献标识码]A[文章编号]1674-4721渊2018冤9渊c冤-0008-04TheinfluenceofEndostatin30peptideonproliferativeactivityandadhe鄄sionabilityofHepG2cellYUJia-qi1ZHAOHang1YANGYang1WEIXing-peng1NIUShu-dong2LIShu-yan3银icalSchool,HeilongjiangProvince,Qiqihar1.QiqiharMedicalSchool,HeilongjiangProvince,Qiqihar161006,China;2.DepartmentofPhysiology,QiqiharMed鄄HeilongjiangProvince,Qiqihar161006,China161006,China;3.DepartmentofBiochemistry,QiqiharMedicalSchool,[Abstract]ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofEndostatin30peptideonproliferativeactivityandadhesionabili鄄tyofHepG2cellforlivercancer.MethodsThenucleotidesequencescorrespondingtoamino-terminal1-31aminoacidsofendostatin(changethe25-31bitsequencefromRGIRGADtoRGDRGD)werelinkedtoplasmidpTYB2,thenactivityandadhesionofcellswereinhibitedintimeanddosedependent,andcomparedwiththecontrolgroup,thereadhesionofHepG2cell,whichisexpectedtobecomeoneoftheadjuvanttherapiesforlivercancer.[Keywords]Endostatin;Proliferation;Adhesion;LivercancerconvertedtotheexpressionofEscherichiacoliBL21(DE3)andsynthesize30peptidescomposedof30aminoacids.wasasignificantdifference(P<0.05).ConclusionEndostatin30peptidecaneffectivelyinhibittheproliferationandResultsAfterHepG2cellsweretreatedby30peptideof0,20,40,60,80,100滋g/mlfor24,48h,theproliferative肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一袁死亡率位居第二袁其特点是恶性程度高袁病情进展快袁术后易复发和转移遥传统的手术尧放疗和化疗等的治疗效果均不理想袁因此袁探索高效低毒的抗肿瘤新药是医药卫生工作者的首要任务遥2005年袁Robert等将内皮抑素分为8个肽段渊hP1~hP8冤袁分别研究其抗肿瘤活性袁实验结果显[基金项目]黑龙江省大学生创新创业训练计划项目渊201611230001冤[作者简介]于佳琪渊1995-冤袁女袁黑龙江齐齐哈尔人袁2014级本科在读袁研究方向院临床医学银示袁内皮抑素的hP1肽段渊即内皮抑素的1耀27位氨基酸构成的肽段冤抗肿瘤活性接近于内皮抑素袁其他肽室刘兴汉教授利用定点诱变技术对内皮抑素氨基端段无活性[1]遥2007年黑龙江省生物医药工程重点实验的1耀31位氨基酸对应的核苷酸序列进行改造袁并将25耀31位氨基酸序列由RGIRGAD改为RGDRGD袁合后的30肽包含两个RGD序列袁易与肿瘤细胞膜上的成了由30个氨基酸构成的30肽[2]渊简称30肽冤遥改造整合素结合袁进而增强30肽的抗肿瘤活性遥本研究选择人肝癌细胞HepG2为研究对象袁探讨内皮抑素30肽对HepG2细胞增殖活性和黏附能力的影响袁为肝癌的生物治疗提供试验依据和临床应用的可能性遥通讯作者院李淑艳渊1968-冤袁女袁黑龙江齐齐哈尔人袁博士袁研究方向院肿瘤生物治疗8CHINAMODERNMEDICINEVol.25No.27September2018中国当代医药2018年9月第25卷第27期窑论著窑1材料与方法1.1实验材料酵母提取物尧胰蛋白胨尧IPTG尧EDTA尧葡聚糖凝胶G15尧Matrigel渊E1270冤渊Sigma公司冤曰RPMI1640细胞培养基渊美国Gibco公司冤曰胎牛血清渊杭州四季青冤曰胰酶渊Invitrogen公司冤曰WST-1试剂盒渊Roche公司冤曰几丁质层析树脂渊NEB公司冤曰人肝癌细胞株HepG2渊本室保存冤遥1.2实验方法析后袁葡聚糖凝胶G15去除DTT干扰袁分别取5尧2滋g进行Tricine-SDS-PAGE小肽电泳袁结果见图1袁在分子量3kDa左右出现特异条带遥1.2.130肽的表达及纯化参考Wang等[3]的纯化方法袁从构建的pTYB2-T30基因工程表达菌中提取30肽袁经几丁质亲和层析纯化后袁通过Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定其纯度遥1.2.230肽对HepG2细胞生长和活力的抑制实验常规方法培养HepG2细胞袁用0.25%的胰酶消化处于对数生长期的细胞袁计数活细胞后袁在96孔板中接种相同数量的HepG2细胞渊每板留1个孔用作空白对照孔冤遥37益袁5%CO2培养箱中孵育过夜袁向各孔中分别图1Tricine-SDS-PAGE检测分析纯化30肽电泳2.230肽对HepG2细胞增殖活性的抑制作用在96孔板中接种相同数量的HepG2细胞袁向各孔中分别加入浓度分别为0尧20尧40尧60尧80尧100滋g/ml的30肽袁37益孵箱中分别处理24尧48h后袁HepG2细胞的增殖活性均被抑制袁呈时间剂量依赖性遥应用线性回归分析计算30肽的IC50为49.7滋g/ml渊图2冤遥加入30肽渊浓度分别为0尧20尧40尧60尧80尧100滋g/ml袁每个浓度设5个复孔冤袁37益孵箱中分别处理24尧48h袁弃培养基袁PBS冲洗袁每孔加入100滋l无血清培养基和10滋lWST-1袁37益孵育1h遥选择450nm为测定波长袁630nm为参考波长袁用酶标仪在570nm处测定各孔吸光度值遥1.2.330肽对HepG2细胞异型黏附能力的影响本实验将Matrigel铺于96孔细胞培养板中袁然后加入不同浓度30肽处理的HepG2细胞袁MTT法检测30肽对HepG2细胞细胞异型黏附能力的影响遥30肽组遥在96孔培养板每孔中分别铺上2滋gMa鄄trigel4益过夜袁加入2豫BSA20滋l/孔袁置于22益1h袁PBS冲洗遥HepG2细胞用0尧20尧40尧60尧80尧100滋g/ml的30肽分别预孵育24尧48h袁调整细胞密度为5伊10个/ml袁100滋l/孔加入细胞悬液袁置于37益细胞培养5图230肽对HepG2细胞增殖活性的抑制作用实验参考Wickstrom等[4-5]的方法遥设立对照组和2.330肽对HepG2细胞黏附能力的抑制作用渊0尧20尧40尧60尧80尧100滋g/ml冤袁培养24尧48h袁显示30肽能显著抑制HepG2细胞对基质胶Matrigel的黏附渊P<0.05冤袁呈时间剂量依赖性渊图3冤遥在HepG2细胞培养液中分别加入不同浓度的30肽箱中孵育90min遥用PBS冲洗掉未黏附的细胞袁加入MTT20滋l/孔袁孵育4h后弃去MTT袁加入100滋l/孔DMSO遥用酶标仪在570nm测定吸光度值袁计算各组的相对黏附率袁每组设3个平行对照袁重复3次遥1.3统计学方法采用统计学软件SPSS19.0分析数据袁计量资料以x依s表示袁组间比较采用方差分析袁采用线性回归分析计算30肽的半数抑制浓度渊IC50冤袁以P<0.05为差异有统计学意义遥2结果2.130肽的表达及纯化重组的内皮抑素30肽经几丁质层析树脂亲和层30肽48h和30肽24h比较袁#P<0.0530肽24h及30肽48h分别与对照组渊剂量=0滋g/ml冤比较袁*P<0.05曰图330肽对HepG2细胞黏附能力的影响3讨论肿瘤的生长尧浸润和转移离不开新生血管的形9CHINAMODERNMEDICINEVol.25No.27September2018窑论著窑中国当代医药2018年9月第25卷第27期成袁内皮抑素位于胶原蛋白愈峪C末端的第一非胶原结构区域[6-7]遥近年来发现其具有抑制肿瘤生长尧改善肺纤维化的作用袁且与其他多种疾病相关[8-10]遥因此袁内皮抑素日益得到研究者的关注和重视遥内皮抑素通过抑制肿瘤组织新生血管的生成袁断绝肿瘤细胞的血液供应袁使细胞处于休眠状态袁间接地抑制肿瘤的生长袁已作为一种抗肿瘤药物用于临床遥但在临床治疗中袁内皮抑素存在单独注射所需剂量大袁内皮抑素蛋白不稳定袁停药后易复发等不足袁对其结构进行改造以减少其毒副作用是临床应用的发展趋势遥人工构建的30肽不仅包括内皮抑素的1耀27位氨基酸活性区袁还含有2个重复的由精氨酸尧甘氨酸和天冬氨酸组成的RGD序列[11-12]遥RGD序列主要存在结合[13-14]袁促进细胞对生物材料的黏附袁抑制肿瘤血管种活动[15-16][1]TjinThamSjinRM袁Satchi-FainaroR袁BirsnerAE袁etal.Aterminalzinc-bindingdomainofendostatinisresponsible[2]LiD袁LiuX袁ZhaoW袁etal.Genecloning袁expressionandac鄄MolBiol袁2007袁4渊6冤院475-479.3663.foritsantitumoractivity[J].CancerRes袁2005袁65渊9冤院3656-[参考文献]27-amino-acidsyntheticpeptidecorrespondingtotheNH2tivityofanti-tumorpeptideofhumanendostatin[J].JMedtwomodifiedanti-tumorpeptideoftumstatin[J].ProgBiochemBiophys袁2007袁34渊11冤院1152-1161.peptideinteractswithintegrinsandregulatesactincytoskele鄄279渊9冤院20178-20185.[3]WangSJ袁LiuXH袁JiYB袁etal.Studyonbiologicalactivityof[4]WickstromSA袁AlitaloK袁Keski-OjaJ.Anendostatin-derivedtonandmigrationofendothelialCells[J].JBiolChem袁2004袁[5]ChenBQ袁YangYM袁GaoYH袁etal.Inhibitoryeffectsofc9袁t11-conjugatedlinoleicacidoninvasionofhumangastriccar鄄9渊9冤院1909-1914.cinomacelllineSGC-7901[J].WorldJGastroenterol袁2003袁[6]PoluzziC袁IozzoRV袁SchaeferL.Endostatinandendore鄄ceravengers[J].AdvDrugDelivRev袁2016袁97院156-173.88渊2冤院277-285.pellin院Acommonrouteofactionforsimilarangiostaticcan鄄nousinhibitorofangiogenesisandtumorgrowth[J].Cell袁1997袁于细胞外基质渊ECM冤蛋白中袁通过与多种整合素特异性生成袁进而影响肿瘤细胞的增殖尧分化尧转移及凋亡等多和生长活性袁实验中选择了人肝癌HepG2细胞为实验遥本研究采用WST-1试剂盒检测细胞存活材料袁在96孔板中接种相同数量的HepG2细胞袁向各孔中分别加入浓度分别为0尧20尧40尧60尧80尧100滋g/ml的30肽袁37益5%CO2孵箱中分别处理24尧48h后袁HepG2细胞的增殖均被抑制袁呈时间剂量依赖性遥肿瘤的侵袭转移是一个连续尧渐进的多因素尧多[7]O忆ReillyMS袁BoehmT袁ShingY袁etal.Endostatin院Anendoge鄄[8]曲波袁秦晓风.重组人血管内皮抑素联合卡培他滨及奥沙临床与康复袁2018袁25渊4冤院443-445.步骤的动态过程袁涉及原发肿瘤细胞的生存发展袁肿瘤细胞增殖能力和生存能力的增强袁肿瘤细胞黏附性的改变袁肿瘤细胞的局部浸润并随着血液循环转移等过程[17-18]遥肿瘤细胞的黏附性改变在肿瘤细胞的浸润利铂治疗胃肠癌合并恶性腹腔积液的疗效[J].中国肿瘤和转移中极为重要遥细胞黏附可分为细胞与细胞间黏附及细胞与ECM黏附遥细胞与细胞间黏附异常时袁肿瘤细胞易从原发灶脱落并黏附到ECM和基底膜袁这分是纤维粘连蛋白渊FN冤尧层粘连蛋白渊LN冤和郁型胶是肿瘤细胞侵袭转移过程的第一步[19]遥ECM的主要成原蛋白袁本研究在体外黏附实验中采用Matrigel渊主要成分是FN尧LN和郁型胶原蛋白冤作为黏附基质袁模拟体内黏附过程遥实验显示袁HepG2细胞对人工基底膜胶Matrigel具有较强的黏附能力袁加入30肽后袁从40滋g/ml开始袁肿瘤细胞对Matrigel的黏附能力明显降低袁并呈时间剂量依赖性袁提示30肽可通过抑制肿瘤细胞对基质成分的黏附作用来降低肿瘤细胞的转移能力袁为临床上生物活性肽用于肿瘤治疗提供了理论和实验依据[20-22]遥终上所述袁内皮抑素30肽能有效抑制HepG2细[9]WanYY袁TianGY袁GuoHS袁etal.Endostatin袁anangiogene鄄sisinhibitor袁amelioratesbleomycin-inducedpulmonaryfi鄄brosisinrats[J].RespirRes袁2013袁14渊1冤院56-68.[10]韩敏袁王坚袁王久胜.重组人内皮抑素结合化疗对晚期非国现代医学杂志袁2018袁28渊9冤院55-59.小细胞肺癌患者血清LMTK-3和IGFBP-7的影响[J].中[11]ThysiadisS袁KatsamakasS袁DalezisP袁etal.Novelc渊RGDyK冤-basedconjugatesofPOPAMand5-fluorouracilforinte鄄渊18冤院2181-2196.grin-targetedcancertherapy[J].FutureMedChem袁2017袁9[12]Bartolom佴RA袁Pel佗ez-Garc侏aA袁GomezI袁etal.AnRGDandtumorgrowth[J].JBiolChem袁2014袁289渊50冤院34801-34814.sioniscontrolledbyc-MYCincolorectalcancercells[J].Oncogene袁2016袁35渊13冤院1671-1678.2017袁9渊9冤院116-149.motifpresentincadherin17inducesintegrinactivation[13]BoudjadiS袁CarrierJC袁GroulxJF袁etal.Integrin琢1茁1expres鄄[14]NieberlerM袁ReuningU袁ReichartF袁etal.Exploringthe胞的增殖和黏附袁在临床上有望成为肝癌的辅助治疗手段之一袁30肽对肝癌HepG2细胞侵袭与转移能力的影响及机制是今后本课题的主要研究目标遥10roleofRGD-recognizingintegrinsincancer[J].Cancers袁渊下转第19页冤CHINAMODERNMEDICINEVol.25No.27September2018中国当代医药2018年9月第25卷第27期窑论河南中医袁2010袁30渊5冤院457-459.著窑削弱其生物学效应袁全面诱导HSC凋亡袁调节ECM的生成以及降解袁全面发挥抗肝纤维化的作用[14]遥本研究中袁治疗前袁两组患者的CL-郁尧PC芋尧LN尧HA比较袁差异无统计学意义渊P跃0.05冤曰观察组患者治疗后的CL-郁尧PC芋尧LN尧HA均低于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤曰两组患者治疗前的STB尧ALT尧ALB指标差异无统计学意义渊P跃0.05冤曰两组患者治疗后的STB尧ALT均低于治疗前袁ALB均高于治疗前袁差异有高于对照组袁ALT低于对照组渊P约0.05冤曰观察组患者第12尧24尧48周的HBV-DNA转阴率均高于对照组袁差异有统计学意义渊P约0.05冤袁提示对于乙肝肝炎肝硬化者袁以恩替卡韦为基础袁加用鳖甲煎丸袁能在一定程度上抑制HBV-DNA聚合酶袁同时减少HBV的复制袁缓解肝脏炎症和纤维化的发生袁降低癌变率尧并发症发生率袁临床效果满意袁值得进一步推广应用遥[1]WangFY袁LiB袁LiY袁etal.EntecavirforpatientswithhepatitisBdecompensatedcirrhosisinChina院ameta-analysis[J].SciRep袁2016袁6院32722.theefficacyandsafetyofentecavirforpatientswithchronichepatitisB[J].EurJGastroenterolHepatol袁2017袁29渊11冤院1314.[2]HuangR袁WangJ袁ZhaoXA袁etal.Theimpactofcirrhosison[3]徐礼通袁杨平.鳖甲煎丸对慢性乙型肝炎早期肝硬化患者西医结合消化杂志袁2014袁22渊1冤院13-15.[5]缪京翔.鳖甲煎丸抗乙肝后肝纤维化作用的机制研究[J].[6]蒋华波袁陆斌.鳖甲在抗肝纤维化和抗肝癌作用中的研究[7]任愉嫱袁蒋燕.鳖甲煎丸治疗慢性乙型肝炎肝纤维化临床[8]徐玉玲袁罗宏伟袁丁沛.鳖甲煎丸对慢性乙型肝炎早期肝硬世界中医药袁2017袁12渊9冤院2077-2079.113进展[J].基因组学与应用生物学袁2017袁36渊4冤院1446-1450.疗效的Meta分析[J].现代中药研究与实践袁2018袁6渊1冤.112-统计学意义渊P约0.05冤曰观察组患者治疗后的STB尧ALB化患者肿瘤坏死因子-琢和基质金属蛋白酶-2的影响[J].[9]黄晶晶袁黄鸿娜袁毛德文袁等.鳖甲煎丸对二乙基亚硝胺诱渊7冤院1489-1491.导大鼠肝癌癌前病变的影响[J].辽宁中医杂志袁2016袁43[10]郑康袁何盟国袁王智翔袁等.鳖甲煎丸和艾迪注射液联合药袁2017袁21渊10冤院1909-1912.肝动脉化疗栓塞治疗中晚期肝癌的疗效观察[J].安徽医[参考文献][11]李烨袁邓存良袁彭颖.灵芪蠲肝胶囊对大鼠肝星状细胞增殖[12]樊尔艳袁贺松其袁文彬袁等.鳖甲煎丸对大鼠肝星状细胞[13]主余华袁张春清袁石军袁等.银杏叶提取物对大鼠肝星状[14]李云静.阿德福韦酯联合拉米夫定治疗乙肝肝硬化失代渊12冤院822-824.脏病杂志袁2006袁9渊3冤院129-132.960-966.24渊2冤院155-159.及TIMP-1表达的影响[J].中药新药与临床药理袁2013袁增殖与凋亡的影响[J].中国中西医结合杂志袁2016袁36渊8冤院细胞细胞因子和胶原合成及细胞增殖的影响[J].实用肝血清肿瘤坏死因子-琢和白细胞介素-6的影响[J].中国中偿期的疗效及安全性评价[J].实用药物与临床袁2012袁15渊收稿日期院2018-05-30本文编辑院许俊琴冤[4]张义红袁井凤玲.鳖甲煎丸联合恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎疗效观察[J].肝脏袁2016袁21渊3冤院197-200.渊上接第10页冤[15]XieF袁DingRL袁HeWF袁etal.Invivoantitumoreffectofen鄄dostatin-loadedchitosannanoparticlescombinedwithpa鄄1410-1418.clitaxelonLewislungcarcinoma[J].DrugDeliv袁2017袁24渊1冤院[16]WangX袁ZhanRY袁WangYY袁etal.Endostatinimproves[17]王峥嵘袁庞静欢袁周艳袁等.FXRmRNA表达量与肝恶性[18]李永庆袁尚培中袁柳勇袁等.VEGF和SLeX表达与甲状腺5-8.1-4.el[J].OncolLett袁2015袁9渊5冤院2023-2030.cancer-associatedsystemicsyndromeinalungcancermod鄄[19]ErreniM袁SiddiquiI袁MarelliG袁etal.TheFractalkine-recep鄄196渊2冤院902-914.toraxisimproveshumancolorectalcancerprognosisbylim鄄itingtumormetastaticdissemination[J].JImmunol袁2016袁[20]吴迅.重组人血管内皮抑素时间窗研究进展[J].西部医[21]RoscaEV袁KoskimakiJE袁RiveraCG袁etal.Anti-angiogenic[22]HamleyIW.Smallbioactivepeptidesforbiomaterialsde鄄14041.2011袁12渊8冤院1101-1116.学袁2017袁29渊12冤院1777-1780.peptidesforcancertherapeutics[J].CurrPharmBiotechnol袁signandtherapeutics[J].ChemRev袁2017袁117渊24冤院14015-渊收稿日期院2017-12-14本文编辑院许俊琴冤肿瘤复发转移关系探讨[J].中国现代医生袁2017袁55渊7冤院乳头状癌浸润转移的关系[J].中国医学创新袁2016袁13渊21冤院CHINAMODERNMEDICINEVol.25No.27September201819