肥大细胞膜稳定剂对实验性重症急性胰腺炎的治疗作用研究

张敏敏;李兆申;屠振兴;满晓华;龚燕芳;张晓华

【摘 要】目的探讨肥大细胞(mast cell,MC)在重症急性胰腺炎(SAP)时的致病作用,了解肥大细胞膜稳定剂对SAP的治疗作用.方法将15只健康雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组、SAP组及MC膜稳定剂处理组.MC膜稳定剂处理组应用MC膜稳定剂色甘酸钠,以50 mg/kg的用量于制模前30 min注入大鼠腹腔进行预处理.使用胆管注射5%牛磺胆酸钠法诱发SAP,观察各组大鼠血清淀粉酶、胰腺及肺组织病理变化、组织髓过氧化物酶(MPO)活性以及肺干湿重比的变化情况.结果SAP组的淀粉酶水平为2 500.0±227.7 U/L,胰腺髓过氧化物酶活性为0.41±0.01U/g湿重,肺干湿重比为4.58±0.29,胰腺病变评分为6.4±0.5,均较假手术组明显增高(P＜0.05).而使用MC膜稳定剂预处理后造模,其淀粉酶水平降为1 894.40±124.37 U/L,胰腺髓过氧化物酶活性为0.38±0.15 U/g湿重,肺干湿重比为4.35±0.13,胰腺病变评分为3.4±0.5,均较SAP组明显减轻(P＜0.05).结论肥大细胞可能在SAP发病过程中起着重要的作用,MC膜稳定剂对SAP可能有治疗作用. 【期刊名称】《中华胰腺病杂志》 【年(卷),期】2003(003)004 【总页数】4页(P226-229)

【关键词】胰腺炎;肥大细胞;色甘酸钠;细胞活素类 【作 者】张敏敏;李兆申;屠振兴;满晓华;龚燕芳;张晓华

【作者单位】200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,

上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科;200433,上海,第二军医大学长海医院消化内科 【正文语种】中 文 【中图分类】R576

近年来研究发现，在急性胰腺炎发病过程中，由于炎性细胞因子瀑布样级联反应被触发，可引发“全身炎症反应综合征”(systemic inflammatory respo-nse syndrome, SIRS)，使急性水肿型胰腺炎发展成为急性坏死型胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)，并最终导致多器官功能障碍综合征(multip-le organ dysfunction syndrome, MODS)发生。因此，防止急性胰腺炎由水肿型向坏死型转化是目前重要的研究课题，细胞因子在急性胰腺炎发病过程中的作用已逐渐受到国内外学者的重视。肥大细胞(MC)广泛分布于结缔组织中的毛细血管及淋巴管周围，被激活后能释放多种促炎性介质，不仅在变态反应中起着重要的作用，在宿主对病原微生物的防御反应以及在免疫调节反应中也发挥着重要的作用。急性胰腺炎时，MC可通过释放各种细胞因子影响胰腺炎的病情变化，为此，我们使用MC膜稳定剂预处理后观察重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)大鼠胰腺组织炎症的变化，探讨MC膜稳定剂对SAP的治疗作用。 材料与方法 一、材料

健康雄性SD大鼠15只，清洁级，体重250 ± 50 g，由第二军医大学实验动物中心提供。牛磺胆酸钠(98%)，色甘酸钠，由Sigma公司提供。淀粉酶测定试剂盒，购自北京中山生物工程高技术公司。MPO检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

二、实验分组

将实验动物随机分为3组，分别为假手术组、SAP组及MC膜稳定剂处理组(n=5)。于术后3 h处死动物采集标本，测定血清淀粉酶、组织MPO和肺干湿重比，观察胰腺组织病理学的改变。 三、动物模型的制备

参照Lankisch等[1]的方法。2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，固定于手术台。正中切口进腹，于十二指肠内侧找到胆胰管，近端用无损伤金属夹夹闭，将注射器针头向十二指肠开口方向插入胆胰管，以0.1 ml/min的速度向胆胰管内推注5%牛磺胆酸钠，剂量为1 ml/kg。5 min后拔除注射针，松开金属夹，连续缝合关闭腹腔。假手术组开腹后翻动胰腺，即关腹。处理组于制模前30 min使用0.5%色甘酸钠，以50 mg/kg的用量注入大鼠腹腔进行预处理。 四、胰腺组织病理评分标准

胰腺组织经HE染色后，参照Rongione[2]等的评分标准(表1)进行病理评分。取各项积分总和为最终得分。 五、血清淀粉酶检测 具体步骤按说明书进行。 六、组织MPO检测

具体步骤按照说明书进行。以37℃ 时分解1 μmol H2O2表示1U MPO活力，MPO活性=△A460 × 13.5/胰腺湿重(g)。 七、肺干湿重比测定

取大鼠的右侧肺，拭去血迹后称重，所得数值为湿重。将肺组织置于60℃烤箱内72 h，去除水分。取出称重，所得数值为肺干重。肺干湿重比为肺湿重/肺干重，该指标反应肺水肿程度。 八、统计学分析

所有数据以 ± s表示，各组间进行t检验。 结 果

一、胰腺组织病理检查结果

大体病理下观察到假手术组的胰腺肺组织无明显变化；SAP大鼠胰腺小叶间中度水肿，可见局灶性腺泡细胞变性坏死；处理组胰腺间质水肿，偶见炎性细胞浸润，无腺泡坏死，血管变化不明显(图1)。胰腺组织病理评分结果见表2。

表1 SAP时胰腺组织病理变化评分标准01234水肿无 小叶间区域水肿 弥漫性小叶间水肿 腺泡肿胀，小叶间隙增大 明显小叶分隔感染无 腺管边缘感染 实质感染<50%小叶 实质感染51%～75%小叶 块状聚集、脓肿出血无 出血面积达0～25% 出血面积达25%～50% 出血面积达50%～75% 出血面积>75%坏死无 胰管周围实质破坏 点状实质坏死<20% 小叶缺失达20%～50% 小叶缺失>50%

表2 各组光镜下胰腺组织学评分(n=5)与假手术组及处理组相比，*P < 0.05组别水肿感染出血坏死总分假手术组

0．0±0．00．0±0．00．0±0．00．0±0．00．0±0．0SAP组2．2±0．8∗1．8±0．8∗1．2±0．4∗1．2±0．4∗6．4±0．5∗处理组1．2±0．40．8±0．41．0±0．70．4±0．53．4±0．5

A、B、C三图分别为假手术组、SAP组、处理组的胰腺组织(HE × 200)图1 各组胰腺组织的病理改变 二、血清淀粉酶

假手术组血清淀粉酶为1 074.0 ± 154.2 U/L，而SAP组血清淀粉酶为2 500.0 ± 227.7 U/L，较假手术组明显增高(P < 0.05)。处理组血清淀粉酶为1 894.4 ± 124.3 U/L，较SAP组明显降低(P < 0.05)，与假手术组无差异(表3)。 三、胰腺MPO

假手术组胰腺MPO为0.21 ± 0.02 U/g湿重，而SAP组胰腺MPO为0.41 ± 0.01 U/g湿重，较假手术组明显增高(P < 0.05)。处理组胰腺MPO为0.38 ± 0.15 U/g湿重，较SAP组明显降低(P < 0.05)，仍高于假手术组(P < 0.05)(表3) 。 四、肺干湿重比

假手术组肺干湿重比为4.21 ± 0.25，而SAP组肺干湿重比为4.58 ± 0.29，较假手术组明显增高(P < 0.05)。处理组肺干湿重比为4.35 ± 0.13，较SAP组明显降低(P < 0.05)，但高于假手术组(表3)。

表3 各组大鼠血清淀粉酶、胰腺MPO和肺干湿重比(n=5)与假手术组及处理组相比，*P < 0.05组 别血清淀粉酶(IU/L)胰腺MPO(U/g湿重)肺干湿重比假手术组1074．0±154．20．21±0．024．21±0．25SAP组2500．0±227．7∗0．41±0．01∗4．58±0．29∗处理组1894．4±124．30．38±0．154．35±0．13 讨 论

MC是神经-免疫-内分泌网络调节过程中的一种关键细胞，参与人体多种生理和病理功能的调节。它来源于骨髓干细胞，在尚未分化且具有分裂能力的阶段即离开造血组织，经血液到达周围组织。MC主要分布在皮肤、呼吸系统和消化系统等部位的黏膜下以及肠系膜、血管、淋巴管的结缔组织中。胰腺及肺中存在着大量的MC[3]。在胰腺组织中，MC多分布于胰腺结缔组织中的血管、淋巴管及神经纤维末梢周围，而在肺内，MC则选择性位于肺外周(如支气管腔和上皮组织内)、肺血管周围、支气管周围和内壁、平滑肌及黏液腺内[4]，这种分布形式提示MC可能在免疫监督方面起着重要的作用。

在急性炎症时，一系列细胞因子通过复杂的细胞因子网络使MC的数量急剧增多[5,6]，并激活MC，促使其脱颗粒，释放炎性介质、酶、肝素以及细胞因子等活性成分，增强局部及全身的炎症反应。

MC释放的介质可大致分为三类：第一类为原先储存于分泌颗粒中的介质，如组胺、蛋白多糖以及MC特异性蛋白水解酶；第二类为新合成的脂质介导的递质，如PAF、前列腺素D2以及白三烯;第三类为细胞因子，包括IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-16、TNF-α以及单核细胞趋化蛋白、单核细胞抑制蛋白等[7,8]。

组胺是一种血管活性物质，能明显增加局部血流量和血管通透性。Akerstrom等[9]发现抗组胺预处理可以减少创伤所引起的白蛋白漏出，其机制可能与毛细血管血压及血流的再调整及防止组胺增加毛细血管通透性有关。这提示，组胺在急性胰腺炎相关的组织充血、水肿发生过程中的作用不可忽视。同时，它又有显著的促胰腺外分泌作用。Singh等[10]通过实验证明MC介导分泌的组胺与胰腺外分泌有关。PAF可引起血小板、中性粒细胞积聚、毛细血管通透性增加和消化道的出血性损害，使用PAF受体拮抗剂可以改善急性胰腺炎的预后[11]。在急性胰腺炎中，TNF-α显著升高，它可引起全身炎症反应和肺间质水肿，可诱发实验动物休克、ARDS和MOF等并发症[12,13]。使用抗TNF-α抗体预处理大鼠可使反映胰腺炎症的各种生化指标明显好转[14]。同样，MC分泌的IL-4、IL-10及IL-13也在急性胰腺炎的发病过程中起着不可忽视的重要作用。因此，作为多种细胞因子产生的一个源头，MC在急性胰腺炎的发病过程中发挥着不可替代的作用。

鉴于以上研究结果，人们试图应用MC膜稳定剂及MC拮抗剂治疗急性重症胰腺炎。Dib等[15]发现在胰腺炎模型中使用MC膜稳定剂能减轻局部及全身的炎症反应，显著减轻胰腺、结肠及肺中的血浆渗出，抑制组胺水平的升高；并可降低结肠、肺中MPO活力及MCP-1的水平，说明MC激活与急性胰腺炎时胰腺组织及胰腺外组织中发生的内皮屏障功能障碍有关，与随后可能发生的MODS及器官/组织特异的内皮屏障功能障碍也有一定的关系[16]。Yonetci等[17]认为MC的激活在急性胰腺炎的开始阶段起着重要的作用，使用酮替芬预处理可以降低大鼠重症急性

胰腺炎的发生率。

在本实验中，我们观察到使用MC膜稳定剂色甘酸钠处理后的急性胰腺炎实验大鼠的胰腺出血坏死、血淀粉酶、胰腺MPO活力以及肺水肿程度均较未处理组明显减轻，与以往的研究结果一致。这说明MC在重症急性胰腺炎发病过程中起着一定的作用，可能与其所释放的细胞因子及其随后的炎症级联反应有关。色甘酸钠预处理后，由于MC细胞膜稳定，使得MC脱颗粒作用明显减轻，各种炎症介质释放明显减少，阻止了急性水肿型胰腺炎向坏死型的转变。但其具体的作用机制尚需进一步的研究。

综上所述，在急性胰腺炎及其相关的多器官功能衰竭等并发症的发病过程中，MC起着重要的作用。这可能与其能够合成及分泌多种炎症介质及细胞因子有关，但其机制仍需我们进一步研究。试想,如果从炎症介质与细胞因子产生源头上对急性胰腺炎的病程加以干预，那么，急性胰腺炎的重症化程度及多器官功能衰竭的发生趋势必将明显下降。 参 考 文 献

【相关文献】

1 Lankisch PG, Ihse I. Bile-induced acute experimental pancreatitis. Scand J Gastroenterol, 1987, 22:257-260.

2 Rongione AJ, Kusske AM, Ashley SW, et al. Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in rat. Gastroenterology, 1997, 112:960-967.

3 Majeed SK. Mast cell distribution in rats. Arzneimittelforschung, 1994, 44:370-374. 4 Schulman ES. The role of mast cells in inflammatory responses in the lung. Crit Rev Immunol, 1993, 13:35-70.

5 Welle M. Development, significance,and heterogeneity of mast cells with particular regard to mast cell-specific proteases chymase and tryptase. J Leukoc Biol, 1997, 61:233-245.

6 Galli SJ, Maurer M, Lantz CS. Mast cells as sentinels of innate immunity. Curr Opin Immunol, 1999, 11:53-59.

7 Vanessa L, John C. Activating and inhibitory signaling in mast cells: new opportunities for therapeutic intervention. J Allergy Clin Immunol, 2000, 106:429-440.

8 Bischoff S C, Lorentz A, Schwengberg S, et al. Mast cells are an important cellular source of tumour necrosis factor alpha in human intestinal tissue. Gut, 1999, 44:643-652. 9 Akerstrom G, Lisander B. Antihistaminergic pretreatment prevents tissue extravasation of albumin from intra-abdominal trauma in rats. Acta Anaesthesiol Scand, 1994, 38:569-574.

10 Singh J, Pariente JA, Salido GM. The physiological role of histamine in the exocrine pancreas. Inflamm Res, 1997, 46:159-165.

11 Johnson CD. Platelet-activating factor and platelet-activating factor antagonists in acute pancreatitis. Dig Surg, 1999, 16:93-101.

12 Grewal HP, Kotb M, el-Din AM, et al. Induction of tumor necrosis factor in severe acute pancreatitis and its subsequent reduction after hepatic passage. Surgery, 1994, 115:213-221.

13 Norman JG, Fink GW, Franz MG. Acute pancreatitis induces intrapancreatic tumor necrosis factor gene expression. Arch Surg, 1995, 130:966-970.

14 Grawal HP, el-Din AM, Gaber L, et al. Amelioration of the physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using an anti-TNF-alpha polyclonal antibody. Am J Surg, 1994, 167:214-219.

15 Dib M, Zhao X, Andersson R, et al. Mast cells contribute to early pancreatitis-induced systemic endothelial barrier dysfunction. Pancreatology, 2002, 2:396-401.

16 Dib M, Zhao X, Wang XD, et al. Role of mast cells in the development of pancreatitis-induced multiple organ dysfunction. Br J Surg, 2002, 89:172-178.

17 Yonetci N, Oruc N, Ozutemiz AO, et al. Effects of mast-cell stabilization in cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Int J Pancreatol, 2001, 29:163-171.