瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌基质金属蛋白及炎症因子的影响

2019年2月

CHINESEJOURNALOFCOMPARATIVEMEDICINE

中国比较医学杂志

February,2019Vol.29　No.2

29(2):66-71.

陈志松,喻卓,曾永利.瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌基质金属蛋白及炎症因子的影响[J].中国比较医学杂志,2019,ChenZS,YuZ,ZengYL.Effectsofrosuvastatinonmyocardialmatrixmetalloproteinasesandinflammatoryfactorsinratswithacutemyocardialinfarction[J].ChinJCompMed,2019,29(2):66-71.doi:10．3969/j.issn.1671-7856．2019．02．0011

瑞舒伐他汀对急性心肌梗死大鼠心肌基质

金属蛋白及炎症因子的影响

陈志松,喻　卓,曾永利∗

(昆明医科大学第一附属医院心血管内科二病区,昆明　650032)

　　【摘要】　目的　观察瑞舒伐他汀治疗急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌组织中基质金属蛋白酶MMPs、TIMP2和

对照组(仅穿线并不在冠状动脉处结扎,n=10);急性心肌梗死组(n=14);瑞舒伐他汀组(n=13):AMI建模后采用瑞舒伐他汀(10mg/(kg·d))治疗;氯沙坦组(n=11):AMI建模后采用氯沙坦钾治疗(5mg/(kg·d))。分别采用免疫组化法、RT-qPCR检测大鼠AMI建模后心肌组织基质金属蛋白酶mmp2、mmp9及抑制物TIMP2的表达水平,采用Westernblot检测心肌组织中mmp2、mmp9及炎性因子TNF-α、IL-1β蛋白变化。结果　免疫组化和RT-qPCR检测结果显示:与AMI组相比,瑞舒伐他汀组及氯沙坦组大鼠心肌mmp2、mmp9蛋白及mRNA表达水平均降低(P<0．05);Westernblot检测结果:与对照组相比,AMI组大鼠mmp9、mmp2、TNF-α、IL-1β蛋白表达水均明显升高(P<0．05);而与AMI组相比,瑞舒伐他汀组、氯沙坦组大鼠心肌中mmp2、mmp9、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均下降(P<可通过抑制心肌纤维化,降低炎性因子表达,在一定程度上对心功能起到改善作用。

【关键词】　瑞舒伐他汀;急性心肌梗死;大鼠;基质金属蛋白;炎性因子

【中图分类号】R-33　　【文献标识码】A　　【文章编号】1671-7856(2019)02-0066-06

0．05)。结论　大鼠AMI建模后心肌发生纤维化因子mmp2、mmp9及炎性因子TNF-α、IL-1β升高,而瑞舒伐他汀

炎性因子TNF-α、IL-1β的变化。方法　选取健康SD大鼠通过结扎冠状动脉左前降支建立AMI模型。分为4组,

Effectsofrosuvastatinonmyocardialmatrixmetalloproteinasesand

inflammatoryfactorsinratswithacutemyocardialinfarction

(DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China)　　【Abstract】　

Objective　Toobservethechangesofmatrixmetalloproteinases(MMPs),TIMP2,andinflammatory

CHENZhisong,YUZhuo,ZENGYongli

∗

factorsTNF-αandIL-1βinthemyocardiumofratswithacutemyocardialinfarction(AMI)treatedwithrosuvastatin.Methods　HealthySDratswereselectedtoestablishanAMImodelbyligationoftheleftanteriordescendingcoronaryartery.

Theyweredividedintofourgroups:acontrolgroup(isolationofanteriordescendingbranchwithoutligation,n=10);anmg/(kg·d)aftermodeling);andalosartangroup(n=11,AMItreatedwithlosartanpotassiumat5mg/(kg·d)after

acutemyocardialinfarctiongroup(AMImodelinggroup);arosuvastatingroup(n=13,AMItreatedwithrosuvastatinat10modeling).ImmunohistochemicalstainingandRT-qPCRwereusedtodeterminetheexpressionlevelsofMMP2,MMP9,and

[基金项目]云南省科技计划项目(2015FB037)。

[作者简介]陈志松(1978—),主治医师,E-mail:hxinyue6688@163.com

[通信作者]曾永利(1975—),主治医师,硕士,主要从事心血管疾病方向的研究。E-mail:logoshes@sina.com

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inhibitorTIMP2inratcardiactissuesafterAMImodeling.WesternblottingwasusedtodeterminethechangesofMMP2,MMP9,TNF-α,andIL-1βinmyocardium.Results　TheresultsofimmunohistochemicalandRT-qPCRanalysesshowedthat,comparedwiththoseintheAMIgroup,theMMP2andMMP9protein/mRNAexpressionlevelsinratmyocardiumintherosuvastatinandlosartangroupsweredecreased(P<0．05).Regardingthewesternblottingresults,comparedwiththatinthethemyocardiumoftherosuvastatinandlosartangroupsweredecreased(P<0．05).Conclusions　Myocardialfibrosisfactorsextentbyinhibitingmyocardialfibrosisandreducingtheexpressionofinflammatoryfactors.

【Keywords】　rosuvastatin;acutemyocardialinfarction;rat;matrixmetalloproteinase;inflammatoryfactorcontrolgroup,theexpressionsofMMP9,MMP2,TNF-α,andIL-1βproteinsintheAMIgroupweresignificantlyincreased(P<0．05).Moreover,comparedwiththoseintheAMIgroup,theexpressionlevelsofMMP2,MMP9,TNF-α,andIL-1βinandinflammatoryfactorsareincreasedafterAMImodelinginrats.Rosuvastatincanimprovethecardiacfunctiontosome

　AMI)　

急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,

要原因是常见的心内科疾病之一,这种疾病对人们的健康状况造成了严重威,也是导致心衰的重胁[1]高,每年大约有。报告显示,我国AMI发病率及死亡率都较

理基础主要是动脉粥样硬化,且有年轻化方向发展50万的新发AMI患者(atherosclerosis,AS),

。发生,其发病率呈上升趋势[2]AMI的病而脂代谢、炎症反应在AS形成过程中起到重要作用。研究显示,他汀类药物保护心肌细胞、降低AMI的发生率、改善心肌重构[3]最新的他汀类药物能降低动脉粥样硬化。瑞舒伐他汀作为目前,逆转动脉粥样斑块以及能够有效降低血脂等指标,并且能降低心血管疾病发生率、死亡率[4]伐他汀对metalloproteinases,MMPs)AMI大鼠心肌外基质金属蛋白酶。本研究探讨瑞舒制剂2(tissueinhibitorof和基质金属蛋白酶组织抑(matrixTIMP2)以及炎性因子蛋白的影响matrix。metalloproteinases,

报道如下。1　材料和方法1．1　实验动物

选择体重180~200g的SPF级成年雄性SD近交系大鼠2015(鼠模型云)2015-0015]60只。动物许可证号:[SCXK(云):通过对大鼠冠状动脉左前降支进行结扎-0023]。实验单位使用许可证编号;适应性喂养7d。建立:[AMISYXK大,将术后24h存活的大鼠用心电图检验确诊存在心肌梗死(1)坦组对照组,其中有:建模后(2)给AMI38只大鼠建模成功予氯组:不用药物治疗。。实验分组(3)氯沙:10(4)瑞舒伐他汀组:给与建模后大鼠瑞舒伐他汀沙坦钾5mg/(kg·d)治疗。行,mg且遵守医院动物伦理委员会规则/(kg·d)治疗。本实验严格按照(福利伦理审3R原则进查编号2018-1-1-5)。

1．2　主要试剂与仪器

美国ABI9700RT-PCR扩增仪;PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成(准字商品名J20090092);:可定,购自阿斯利康制药有限公司;瑞舒伐他汀钙片基质金属蛋白MMP-2、MMP-9、

,国药TIMP2、TNF-α、IL-1βBD物基因技术有限责任公司合成公司;MMP2、MMP9蛋白兔多克隆抗体购自美国引物均由北京博大泰克生;逆转录试剂购自日本TaKaRa公司。1．1．3　3．1　试验方法

构建造模与给药方法

AMI模型:大鼠麻醉后,固定在手术台上,

沿左侧第4肋间剪开皮肤,分离肌肉组织暴露胸腔,在左冠状动脉前降支进行结扎,逐层关闭胸腔并进行常规消毒处理,将术后24h存活的大鼠用心电图检验确诊存在心肌梗死;假手术组大鼠仅于左冠状1．动脉前降支穿线而不作结扎3．2　心肌组织标本采集。

干预后将所有大鼠均经断头法处死,迅速开

胸,摘取心脏,以生理盐水冲洗血液,采集梗死边缘区心肌组织,置于福尔马林溶液中固定245h,常规1．制作石蜡切片3．3　免疫组化检测大鼠心肌,厚度4μm。

采用免疫组化SP法。取大鼠心肌组织标本MMP2、MMP9蛋白表达,

经4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,4μm厚切片。切片常规脱蜡、水化,置于pH6．0的枸橼酸盐缓冲液中微波加热修复,HMMP2、MMP9抗体,37℃22O2封闭,滴加适量稀释的大鼠h,PBS冲洗8min共3次min,加入二抗共3次,DAB(1∶200),37℃显色37℃20孵育min,1苏木素复染h,PBS冲洗,脱8水1．,3．透明4　,RT-封片qPCR,显微镜下观察检测大鼠。心阳性反应呈棕色肌MMP2、MMP9

。mRNA表达水平

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分别取各组大鼠心肌组织30mg,按总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒说明书分别提取各组总RNA及逆转录合成cDNA模板,取2μLcDNA用于RT-PCR反应。GAPDH作为内参,上游引物:5′-AGAGGATACCCCAAGCCACT-3′;下游引物:5′-5′-TCAGTCGATCACTAGCGTCAAT-3′;下游引物:5′-5′-GCCGTCTACTCCTCCCCGTGT-3′;下游引物:5′-ACAGAACAATAGGCACAAACG-3′;MMP2上游引物:CTAACTTCTCCCCACAGGGA-3′。MMP9上游引物:GTCTCTCTCCTACCCTCTGG-3′。RT-qPCR反应条件:预变性94℃30s,变性95℃15s,退火60℃30s,

果分析40个循环:样品的相对表达用,独立实验重复32次-ΔΔCt。表示用系统软件进行结1．3．5　经BCA免疫印迹分析

。

法蛋白定量后上样,SDS-PAGE凝胶电

泳分离蛋白质:制备5%浓缩胶及12%的分离胶。电泳:调解电压至80V、90min后转为100V至溴酚蓝跑至距分离胶底部mA春红染液中浸泡恒流1h,结束后关闭电源取出0．5cm时停止10min,如有条带显现说明转膜成PVDF。转膜膜,:280在丽功,采用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1．5h。加一抗37℃2用Quantityh,、β-actin结束后用(1∶One软件对蛋白质条带进行分析TBST2000),4℃漂洗10冰min箱过×3夜次。,后显影加二抗,测定。其吸光度值。目的蛋白的相对表达强度=目的蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1．4　统计学方法

应用SPSS17．0软件对数据进行统计分析,计量资料采用平均数±标准差(x■±s)表示,两组间比较采用t检验,以P<0．05为差异具有统计学意义。2　结果

2．1　免疫组化检测大鼠心肌MMP2、MMP9蛋白表达

分析大鼠急性心肌梗死建模后14d心肌免疫组化染色结果,AMI大鼠MMP2、MMP9染色面积与对照组相比有差异(P<0．01);瑞舒伐他汀组和氯沙坦组的<0．05),MMP2、MMP9染色面积与AMI组比较有差异(P2．2　

RT-qPCR与对照组比较有差异检测大鼠(心P<0．肌05)。MMP2(图、MMP9

1、2)

mRNA表达水平

MMP2观察建模后mRNA相对表达量与对照组相比明显增加

14d大鼠,结果显示AMI组大鼠的

图1　急性心肌梗死大鼠心肌MMP2免疫组化(×200)Figure1　

MMP2expressioninthemyocardiumofratswithacute

myocardialinfarction(immunohistochemicalstaining)

图2　急性心肌梗死大鼠心肌MMP9免疫组化(×200)Figure2　

MMP9expressioninthemyocardiumofratswithacute

myocardialinfarction(immunohistochemicalstaining)

(达量P<0．(瑞舒伐他汀组01);而用药后大鼠的,氯沙坦组MMP2)与AMImRNA组相比明显的相对表下降,两者有显著性差异(P<0．05);同时,AMI组大鼠的MMP9mRNA相对表达量与对照组相比明显增加(P<0．01);而用药后大鼠的MMP9mRNA的相对表达量(瑞舒伐他汀组,氯沙坦组)与AMI组相比明显下降(P<0．05)。(表1)

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表1　各组大鼠MMP2、MMP9mRNA相对表达量比较

Table1　ComparisonoftherelativeexpressionofMMP2andMMP9mRNAineachgroup

对照组Controlgroup1．06±0．2131．04±0．10

AMI组AMIgroup

瑞舒伐他汀组Rosuvastatingroup2．94±1．09#0．25±0．08#

氯沙坦组Losartangroup1．83±0．40#0．57±0．14#

MMP2mRNAMMP9mRNA

6．13±1．55∗1．47±0．11Δ

2．3　Westernblot结果

注:与对照组比较,ΔP<0．05,∗P<0．01;与AMI组比较,#P<0．01。

Note.Comparedwiththecontrolgroup,ΔP<0．05,∗P<0．01.ComparedwithgroupAMIgroup,#P<0．01.

无促进再生作用,有些治疗甚至会促进心肌细胞凋亡及心室重构[7]。因此,为改善急性心肌梗死患者预后而阻止心肌细胞凋亡有着重要意义。

本实验采用开胸结扎冠状动脉左前降支的方法建立AMI大鼠模型,此方法具有成熟、成功率高等特点,一般用于观察研究急性心肌梗死的病理变化[8]。此次实验模型成功率为76%,失败模型主要由于技术不熟练、操作不规范等造成。

基质金属蛋白(MMPs)主要由巨噬细胞分泌的对锌离子依赖内肽酶,能够对多种胶原纤维和细胞外基质产生降解作用,使心肌细胞受损,梗死区域增大[8]。MMP-2和MMP-9属于MMPs家族中重要成员能降解胶原和基底膜成分,导致重构心肌胶原网络,而TIMPs能抑制其活性。动物模型实验结果发现:心肌中MMPs的表达水平随着心脏功能障碍的发展逐渐增加,同时会使细胞外基质成分、结构改变[9]。国外文献报道,心肌重塑与MMP-9、

与对照组相比较,AMI组TIMP2蛋白表达水平明显下降(P<0．05),但瑞舒伐他汀组、氯沙坦组与AMI组相比,TIMP2蛋白表达水平均上升(P<0．05);与对照组相比,AMI组大鼠MMP9、MMP2、

TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均升高(P<0．05);而与AMI组相比,瑞舒伐他汀组、氯沙坦组大鼠心肌中MMP2、MMP9、TNF-α、IL-1β蛋白表达水平均下降(P<0．05),瑞舒伐他汀组、氯沙坦组之间无差别(P3　讨论

>0．05)。详见图3、4。

病率不断升高且有年轻化趋势[5],这给患者健康带来严重危害。文献报道,心梗后心力衰竭的主要病理原因是心肌细胞凋亡和胶原纤维增生[6]。现有的治疗方法能够部分改善患者预后,但对心肌细胞

在临床上,急性心肌梗死是常见的病症,其发

注:与对照组相比,∗P<0．01;与AMI组相比,#P<0．05。

图3　大鼠建模后心肌TNF-α、IL-1β蛋白表达水平变化

Note.Comparedwiththecontrolgroup,

∗

P<0．01.ComparedwiththeAMIgroup,#P<0．05.

Figure3　ChangesofTNF-αandIL-1βproteinexpressioninratmyocardiumaftermodeling

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注:与对照组相比,∗P<0．01;与AMI组相比,#P<0．05。

图4　大鼠建模后心肌MMP2、MMP9、TIMP2蛋白表达水平变化

Note.Comparedwiththecontrolgroup,

∗

P<0．01.ComparedwiththeAMIgroup#P<0．05.

Figure4　ChangesofMMP2,MMP9,andTIMP2proteinexpressioninratmyocardiumaftermodeling

MMP-2关系密切[10]。本试验中免疫组化和Western

blot结果表明:与对照组相比,AMI组大鼠心肌组织中MMP-2和MMP-9蛋白表达量明显增加,同时Westernblot检测AMI组心肌中TIMP2蛋白表达量下降;与AMI组相比,瑞舒伐他汀组和氯沙坦组心肌MMP-2和MMP-9蛋白表达水平下降,而TIMP2蛋白表达水平上升;RT-qPCR检测结果表明,AMI组大鼠心肌组织中MMP-2mRNA比对照组增加(P<0．05),但与AMI组相比,应用瑞舒伐他汀及氯沙0．05),但应用瑞舒伐他汀及氯沙坦治疗后MMP-9

改善心肌重构和心脏功能的目的[9,12]。实验结果说明瑞舒伐他汀能够调节MMPs和TIMP2的表达,达到改善心肌重构以及心功能作用。

对AMI的病理研究发现,炎性反应是主要的发病机制之一,其主要标志物为IL-6、IL-1β及TNF-α等[13]。单核巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α等共同诱导心肌细胞凋亡[14]。TNF-α与急性期炎性反应联系紧密,且能够加强IL-1β、IL-6表达[15]。本实验中建立AMI大鼠模型会促使心肌细胞大量坏死,同时大量释放炎症因子TNF-α、IL-1β等。Westernblot检测结果:与对照组相比,AMI组大鼠TNF-α、IL-1β蛋白表达水平明显增加(P<0．05),这说明炎症反应参与AMI的病理过程。AMI大鼠服用瑞舒伐他汀及氯沙坦治疗后治疗14d后,与AMI组大鼠相比较心肌中TNF-α、IL-1β蛋白表达量明显下降(P<0．05),说明瑞舒伐他汀及氯沙坦具有对抗急性心肌梗死大鼠炎症反应的多样化作用。有体外研究证明,他汀类药物能够通过减少粘附分子数量和炎症因子起到抗炎作用,这和本研究结果基本一致[16]。

综上所述,瑞舒伐他汀对AMI大鼠心脏功能改

坦治疗后MMP-2mRNA降低(P<0．05);与对照组相比,AMI大鼠心肌组织中MMP-9mRNA增加(P<

mRNA降低,与AMI组相比有差异(P<0．01),这表MMPs。

明瑞舒伐他汀和氯沙坦能够明确抑制心肌中

他汀类药物是HMG-COA还原酶抑制剂,具有

抗炎、抑制心肌纤维化、降脂、抗氧化等作用[8]。瑞舒伐他汀也属于HMG-COA还原酶抑制剂能够竞争性抑制胆固醇合成关键酶,并且加速低密度脂蛋白代谢,降低其密度,从而改善心脏功能[11]。据文献报道,瑞舒伐他汀能通过抑制巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶从而减轻心肌纤维化,减少胶原沉积达到

善有明显作用,通过调节MMPs、TIMP2表达改善

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AMI大鼠的心肌重构,同时瑞舒伐他汀能够抑制炎性反应,减少对炎症因子对心肌的毒害作用,表明他汀还具有抗炎的多效性作用。

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