黑暗链霉菌aprf-g基因功能的研究

aprF—G基

因功能的研究

朱碧银，

洪文荣。，

李辉

(福州大学生物科学与工程学院．福建福州350108)

摘要：以研究黑暗链霉菌Tt-49中生物合成基因aprF—G生理功能为目标，利用接合转移法，将同源重组质粒pFDl0导入黑暗链霉菌Tt一49，最终获得同源双交换茵株Tt一49G53，并对其生理特性进行考察。结果显示：其生长速度明显比亲株慢，产抗水平比亲株低100倍，仅为

13

U／mL。采用薄层层析法对其代谢产物进行分析，未检测到安普霉素。

关键词：黑暗链霉菌；基因重组；分子遗传工程中图分类号：Q781

文献标志码：A文章编号：1673—1689(2012】04—0391--05

Study

on

GeneFunctionsofaprF-GinStreptomycestenebrarius

ZHUBi—yin，HONGWen—rong’LIH

ui(CollegeofBiological

ScienceandTechnology．FuzhouUnvercity，Fuzhou350108，China)

Abstract：Inorder

to

blockbiosynthesis

genes

aprFandaprGofapramycininStreptomyces

tenebrariusTt一49，recombinantplasmidpFDl0wasintroducedtoS．tenebrariusTt一49byconju—

gation．Anddouble

crossover

mutantTt一49G53wasobtainedfinally．Preliminaryresearch

on

physiologicalcharacteristicsfordoublecrossover

mutantTt-49G53wasconducted．Theresults

showedthatdouble

crossover

mutantTt-49G53grewmoreslowlythanparentstrain．thelevel

ofantibioticproductionwas13

u／mL，which

was

100

times

lowerthanthe1evelof

parent

strain．ThemetabolicproductswereanalyzedbyTLC．Apre-judgmentoftheresult

wasthat

double

crossover

mutantTt一49G53couldn'tproduceapramycin．ItwassupposedthataprFand

aprGw

erenotcloselyrelatedtosecondarymetabolismofS．tenebrariusonly，butalsowasas—

sociatedwiththegrowthanddevelopmentofproducingstrain．

Keywords：Streptomycestenebrarius，generecom

binant，moleculargeneticengineering黑暗链霉菌产生3种主要组分：氨甲酰妥布霉和应用，特别是安普霉素和妥布霉素生物合成基因素、安普霉素及氨甲酰卡那霉素B。由于上述3种簇的公布及部分基因功能的陆续确定，加速了在分化合物都含有巴龙霉胺结构，因此，推测3种组分子水平上对黑暗链霉菌进行定向改造的步伐。理的生物合成基因簇可能存在部分重叠，都有共同的想的策略就是阻断妥布霉素或者安普霉素生物合巴龙霉胺生物合成途径，之后再分支生成3种不同成的任一途径，获得主合成安普霉素或者妥布霉素的化合物口1]。基因阻断和基因替换技术[5]的发展

工程菌。本研究期望采用基因工程技术对妥布霉

收稿日期：2011--05--20

基金项目：国家自然科学基金项目(31070093)i国家。十二五”科技攻关重大专项资助项目(2012ZX09201—101-008)I福建省教育厅科研项

目(2007F5070)。

*通信作者：洪文荣(1956一)，男．福建蒲田人，教授，理学博士。硬士研究生导师．主要从事微生物制药面的研究。

E-mail：hongwr58@163．eom

食品与生物技术学报20I2；I

m3l招讹41“：o

ZHU8i—yin．etal：Study

oilGeneFunctionsof

aprF-Gin

Streptomyces

tenebrerius

素工业化生产菌株黑暗链霉菌Tt一49进行品质改良，构建其同源重组系统、以期阻断其安普霉素的生物合成，最终获得不产安普霉素的工程菌。同时，期望以黑暗链霉菌为模型，建立实用型基因打靶操作平台，为重要药用工业微生物的品质改良奠定基础。

1．3主要试剂

限制性内切酶、Taq酶、T。DNA连接酶和

DNAmarker：购自TaKaRa公司；DNA回收试剂

盒、蛋白胨、肉浸液和牛肉浸膏：购自上海生工生物工程技术服务有限公司；732阳离子交换树脂：购自长沙市大禹化工有限公司；薄层层析硅胶GF254：购自安徽良臣硅胶源材料有限公司；其它化学试剂均为国产分析纯或色谱纯。I．4转化方法

穿梭质粒pFDl0导入黑暗链霉菌Tt一49采用接合转移法，具体参见文献[7—8]。1．5发酵代谢产物分析方法

发酵效价采用生物检定法[6f9]。采用薄层层析法[1…，用硅胶GF254薄层层析测定发酵液中抗生素成分的组成。取发酵样品、安普霉素和妥布霉素标准品，分别加水制成每1mL含10mg的溶液，吸取上述两种溶液各2“L，分别点于同一硅胶层析板，以氯仿一乙醇一浓氨溶液(1：7。4)为展开剂，展毕晾干，进行碘吸附显影。

1．1质粒和菌株

大肠杆菌一链霉菌穿梭质粒pFDl0：作者所在实验室构建，结构见图1。含有用于黑暗链霉菌Tt-49染色体中基因aprF-G同源重组的两侧交换臂，分别为aprF-G的上游同源区段JHBl(2游同源区段JHB2(1

853

165bp)和下

tI18Ⅲ／

bp)；两侧同源交换臂之间

为红霉素启动子基因ermE’和绿色荧光蛋白基因gfPdHBl外侧连接的是红霉素抗性基因(用于同源交换菌株的筛选)；含安普霉素抗性基因、接合转移起点oriT和温敏型复制子。该质粒不仅可在大肠杆菌中自主复制，而且能在链霉菌中复制。

…Hi枷1∑=二!一

2．1

阻断突变株的筛选

将穿梭质粒pFDl0转化Ecoli

ETl2567／

＆出pn厂laac(3)ll／～pFDl0眷+

。

jj-岛p

pUZ8002，再通过接合转移将其导入黑暗链霉菌Tt-49。由于穿梭质粒pFDl0拥有温敏型复制启动子，当培养温度超过34℃时，该游离质粒在链霉菌中不能自我复制[1“。因此，转化后直接在35℃下培养，17h后在培养的平板上覆盖红霉紊和萘啶酸，长出的菌落可能为穿梭质粒pFDl0插入到染色体上。筛选到的抗性重组菌存在两种可能，即不同的交换臂进行单交换(图2Ⅱ、Ⅲ)。将筛选到的阳性转化子，在含萘啶酸和红霉素的HSB平板培养基上经3次传代培养，彻底清除E．coliETl2567／pUZ8002后，在无抗性平板上松弛传代培养1～2代，分离单菌落，分别在无抗性平板和抗性平板上进行影印培养，得到的菌株可能有两种状态：回复突变株(图2Ⅳ)和双交换菌株(图2V)。2．2阻断突变株的验证

穿梭质粒pFDl0的红霉素抗性基因位于交换臂外侧，便于双交换筛选。但由于双交换菌株和野生型菌株的表型相同(均对红霉素敏感)，因此，通

印≮二州孟铆1彳＼√0，f夕抽引¨2

圈1

Fig．1

pF'DIO质粒圈谱

MapofplasmidpFDIO

大肠杆菌(E．coli)DH5e、E．coliETl2567／pUZ8002和黑暗链霉菌Tt-49均为作者所在实验室保存。

1．2抗生素和培养基

Ecoli培养基为LB，根据特性添加抗生素，相应

培养基中使用的氨苄青霉素终质量浓度为i00pg／mL，卡那霉素和安普霉素的终质量浓度均为50肛g／mL，红霉素与氯霉素终质量浓度均为25I,g／mL；黑暗链霉菌斜面培养基(HsB)、种子和发酵培养基见文献[6]，培养基中使用的红霉素抗性和萘啶酸的终质量浓度为25pg／mL；接合转移使用MS培养基[7]。

●Journal

of

—■—衄裔

FoodScienceandBo．42012iotechnologyV01．31N

：

．f卜一_王一?=：．二!_1●!一1i五弹，

朱碧银．等：黑暗链霉菌aprF—G基因功能的研究

过红霉素抗性筛选首先获得单交换菌株，共获得单交换菌株9株，分别命名为Tt-49Gll～19，再由单交换菌株Tt一49Gll～19发生第二次交换，通过单菌落分离和影印培养，获得双交换菌株Tt一49G53。提取Tt-49G53染色体DNA，进行PCR验证。PCR验证引物分别为Pyl／Py2(图2II中箭头所示)、Py3／Py4(图2Ⅳ、V中箭头所示)和Py5／Py6(图2III中箭头所示)，Pyl／Py2和Py5／Py6的序列参见文献[1川，Py3／Py4的序列分别为：5’一CGTTGAGC—

CGATATCCGT一3’：5’一CGTCGAGACGATGCG—

行PCR，aprF-O基因被gfp和ermE。替换后的突变株扩增分别得到2菌PCR结果得到1

703bp和2576

bp的单一条

带；用引物Py3／Py4进行PCR，发生单交换的重组

705bp和1437

bp两条扩增条

带，以亲株基因组为模板进行PCR得到单一的1

705

bp条带，而aprF-G基因被gYp和ermE。替换

437

后的突变株扩增得到单一的1bp。结果见图

3。回收引物Py3／Py4的PCR扩增产物，将其克隆到pMDl9一T载体上，转化大肠杆菌DH5a，大肠杆菌菌体呈绿色，将该克隆子进行测序，结果与预测相符，进一步证实菌株Tt-49G53为双交换菌株。

TAA一3’。如图2所示，用Pyl／Py2和Py5／Py6进

IV

V

JHBt

ermE*gfp

JHB2

1：JHBl端的同源交换；2：JHB2端的同源交换

图2同源重组示意图

Fig．2

Sketchmbinationapofhomologousrecom

2．3双交换菌株Tt-49G53的菌落形态

双交换菌株Tt-49G53菌落(图4a)产米白色孢子，但孢子量明显少于亲株(图4b)，表面粗糙，有皱褶，中问凹陷，产红棕色色素，于37℃恒温培养5d后，菌落形态与亲株接近，由此可见，双交换菌株Tt-49G53相较于亲株来说，生长周期明显要

长。这可能是因为aprF和aprG的破坏在一定程度上影响了菌丝的生长和孢子的形成。2．4双交换菌株Tt

49G53的发酵结果

将

2．4．1缺陷型工程茵与亲株发酵单位的比较

缺陷型工程菌(双交换菌株Tt一49G53)和亲株分别传至斜面培养基培养，37℃恒温培养5d后，待缺

陷型工程菌和亲株孢子长出后，转接种子培养基，经过种子培养和发酵培养后，收集缺陷型工程菌和亲株的发酵产物，测定缺陷型工程菌和亲株发酵处理液的效价，亲株的发酵单位为1

309

2．4．2工程茵发酵组分的考察将双交换菌株

Tt一49G53与亲株同时在不添加抗生素的种子以及发酵培养基中发酵，并在发酵结束时对发酵液的组分进行薄层层析分析，结果见图5。实验结果显示，双交换菌株Tt一49G53阻断了安普霉素的合成。

U／mL，缺陷

／mL，缺陷型工程菌的型工程菌的发酵单位为13U

发酵单位明显低于亲株。王新路等[9]采用单交换的方法对aprF和aprG分别进行破坏，虽然结果显示aprF阻断突变株和aprG阻断突变株均不合成安普霉素，但是未指出上述两种阻断突变株的生产能力有如此明显的下降。此外，本研究在同时破坏安普霉素生物合成基因簇中aprF、aprG以外的6个ORF时，获得的缺陷型菌株生长周期和菌落形／mL左态与亲株相似，生产能力可维持在500U右。本研究同时破坏了aprF和aprG，却导致缺陷型菌株生长缓慢，产孢子能力明显低于亲株，且生产能力大幅度下降。由此可以推测，aprF、aprG和黑暗链霉菌的次级代谢产物的合成密切相关。

1

2

’4

5

6

7

氨甲酰妥布霉察-◆

．_安普霉素

I

1

，．3

4

t氨甲酰妥布霉素标准品组成；2：亲株Tt一49发酵液组分；3：双

交换菌株Tt一49G53发酵液组分}4：安普霉素标准品组成

圈5双交换菌株Tt-49G53和亲株发酵液薄层层析图谱

Fig．5

TLCresultsofdoubleparent

strainTt-49

crossover

strainTt-49G53and

质粒pFDl0通过E．coliETl2567／pUZ8002去甲基化修饰后，经接合转移进入黑暗链霉菌Tt一

1：Tt-49G53Pyl／Py2

PCR产物；2／5：Tt一49G53Py3／Py4PCR产

49，利用红霉素抗性筛选，得到了9株pFDl0阻断突变株中间体～单交换菌株，依次命名为Tt一49AGll～19；以这些单交换菌株的混合物，进行双交换筛选，最终获得发生同源交换的双交换菌株Tt-49G53。

NAMR产物；4：DL5000Darker；6：物I3：Tt一49G53Py5／Py6PCPy3／Py4PCRproductsofsingleproductsof

parent

strain

crossover

strain；7：Pya／Py4PCR

Tt一49

圈3双交换菌株Tt-49G53的PCR验证

Fig．3

PCRverificationofdouble

crossover

strainTt-49G53

通过对双交换菌株Tt一49G53生理特性的考察，发现其生长速度明显比亲株慢，其产抗水平仅为13U／mL，比亲株低约100倍。采用薄层层析的方法对其代谢产物进行分析，实验结果表明，双交换菌株Tt-49G53未检测到安普霉素。由此推测，

a)双交换菌株Tt．49953

(b)亲株Tt一49

aprF—G不仅与黑暗链霉菌的次级代谢产物合成密切相关，而且与产生菌的生长发育密切相关。

a：双交换菌株Tt-49G53；b：亲株Tt一49

图4双交换菌株Tt-49G$3和亲株Tt-49菌落形态比较

Fig．4

ComparativeofcolonymorphologyofdoublestrainTt-49G53andparentstrainTt-49

crossover

基因功能的研究朱碧银，等：黑暗链霉菌aprFG

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