水稻原生质体提取及转化

1. 将水稻种子去壳后，用70%酒精清洗30 sec，再用30% 次氯酸钠溶液浸泡30 min。 2. 将消毒过的水稻种子植于1/2 MS培养基中，避光培养12-14天后，得到的黄化苗可进行原生质体提取。

3. 现配20 mL enzyme solution并置于5 公分塑料培养皿中。

4. 取黄化苗水稻茎部用锋利刀片细切至0.1-0.5 mm置于enzyme solution中。 5. 将含有水稻材料的enzyme solution 抽气15-20 cm-Hg，15-30 min。 6. 28℃，40 rpm持续震荡3 hr。 7. 28℃，80 rpm继续震荡30 min。

8. 用300目尼龙网布过滤含有原生质体的enzyme solution，将过滤的enzyme solution 250g离心3 min。

9. 去除上清液，小心用W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。 10. 再次用250g离心1 min。

11. 去除上清液，加入W5 buffer将原生质体重新冲洗悬浮。 12. 原生质体置于冰上30 min后可进行PEG转化。

13. 30 min 稍微离心去除上清液，加入MMg solution 使原生质体总数为2-5×105。 14. 取5-10 μg Plasmid DNA 体积为20μL，加入200μL 原生质体，置于冰上10 min。 15. 加入等体积PEG4000溶液，小心混匀并置于室温下15 min。 16. 加入1 mL W5稀释并终止反应，100g离心2 min。

17. 去除含有PEG4000的上清液，加入W5或Incubation Solution重新悬浮并置于用0.1% BSA浸泡过的塑料培养皿中培养。

18. 原生质体在28℃，40rpm 暗培养12-16 hr后用激光共聚焦显微镜观察。

试剂配方：

Enzyme solution Cellulase RS (Yakult) macerozyme R10 (Yakult) MES pH5.6

mannitol (fresh prepare) Heat 55℃,10 min and cool at RT CaCl2.2H2O

0.45 μm Filter sterilized

0.1% 2% 1% 0.1% 0.4 M

W5 Solution Working 154 mM NaCl 125 mM CaCl2 5 mM KCl 2 mM MES (pH5.7) 5 mM glucose Add H2O

MMg Solution Working

0.4 M mannitol (fresh) 15 mM MgCl2 Add H2O

PEG Solution (40%,V/V) Stock

PEG 4000 (Fluka,81240) 0.8 M mannitol 1 M CaCl2 Add H2O

4 g 1.093 g 1 mL

Final concentration 40% 0.6 M 0.1 M Final to 10 mL

Stock 0.8 M 1 M

Add 7.5 mL 0.15 mL final to 200 mL

Stock 3 M 1 M 0.2 M 0.1 M 0.1 M

Add 10.3 mL 25 mL 5 mL 4 mL 10 mL final to 20 mL

将PEG solution 与55 ℃水浴溶解，冷却后可进行转化

Incubation Solution (10 mL) Working 0.6 M mannitol 4 mM MES pH5.7 4 mM KCl Add H2O

Stock 0.8 M 0.1 M 0.2 M

Add 7.5 mL 0.4 mL 0.2 mL 1.9 mL