・ １２ ・ 《上海畜牧兽医通讯》２０１２年第５期 猪黏膜免疫系统的重要性及其检测方法的研究 许宝华 袁 俊 何锡忠 张春玲 李春华。 王 英 蒋凤英ｚ＊ （１南昌大学医学院 南昌 ３３０００６ ２上海市农业科学院畜牧兽医研究所 上海 ２０１１０６） 【摘要】通过对黏膜免疫系统的构成、黏膜免疫反应、猪黏膜免疫系统的功能以及黏膜免疫系统的检测四方面内 容的阐述，介绍了猪黏膜免疫系统的重要性及其检测方法的研究近况，为疫苗免疫效果提供新的评价方法以及为相 关生物制品的发展提供重要技术支撑。 关键词：猪黏膜免疫系统；疫苗免疫；生物制品 自２Ｏ世纪６ｏ年代黏膜免疫概念产生以来，黏膜免疫系 统（Ｍｕｃｏｓａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ，ＭＩＳ）就一直被国内外学者所 关注。动物机体内存在着强大的黏膜免疫系统，约占机体淋 巴组织的５Ｏ 以上…，其在抵抗感染方面起着极其重要的作 用。像其它动物机体一样，猪体内也存在着黏膜免疫系统， 黏膜免疫系统是猪机体整个免疫网络的重要组成部分，又是 具有独特结构和功能的独立免疫体系，它在抵抗感染方面起 着极其重要的作用。黏膜表面是猪体与外界抗原直接接触， 抵抗感染的第一道重要防线。实验证明：通过黏膜免疫后， 黏膜局部的抗体比血清抗体出现得早、效价高，且维持的时 间长 ，其抗体水平更能体现疫苗免疫保护情况。对猪肠道 黏膜免疫及检测方法的研究将为肠道疫苗设计提供重要的 理论基础和新的思路，从而对于预防动物传染性疾病的发生 将发挥重要的作用。因此，研究猪肠道黏膜免疫及检测方法 无论在理论上还是在生产实践上均具有重要意义。 １黏膜免疫系统的构成 黏膜免疫系统主要由黏膜相关淋巴组织（Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｓ ｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ，ＭＡＬＴ）构成。所谓黏膜相关淋 巴组织，即沿着呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜上皮，并存 在于上皮下的淋巴组织，是黏膜接触并摄取抗原和进行最初 反应的部位。ＭＡＩ Ｔ主要包括以下三个部分： １．１ 肠黏膜相关淋巴组织（Ｇｕｔ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ．ＧＡＩ Ｔ） １６７３年，ｄｒ．ｐｅｙｅｒ ｊ．Ｃ．在哺乳动物肠道黏膜上发现了 小肠下的淋巴集结，并称之为派尔氏结（ｐｅｙｅｆｓ ｐａｔｃｈｅｓ，ＰＰ）， 研究表明ｐｐ具有明显的淋巴上皮及上皮下大量淋巴组织， 淋巴组织中有多量的淋巴滤泡，覆盖滤泡的上皮细胞被称之 为Ｍ细胞（Ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ ｃｅｌｌｓ），这种滤泡上皮称为滤泡相关上 皮（Ｆｏｌｌｉｃｌｅ—Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ，ＦＡＥ）。在猪的末端回肠Ｍ 细胞含量高达１００ 。Ｍ细胞的主要功能是摄取并转运抗 原，尤其是转运颗粒性抗原至位于其下方的组织。 Ｍ细胞与普通黏膜上皮细胞不同，在它的表面没有致密 的刷状纤毛，取而代之的是稀疏的绒毛状结构，这有利于Ｍ 细胞摄取大分子抗原，甚至细菌和病毒，抗原穿越黏膜的屏 障，传送到下面的淋巴样组织中去，诱导产生特异的黏膜免 疫反应。 。 １．２ 支气管黏膜相关淋巴组织（Ｂｒｏｎｃｈｕ＞Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ，ＢＡＬＴ） 人们对ＧＡＬＴ研究的同时，对ＢＡＬＴ的认识也不断加 深。Ｂｉｅｎｅｓｔｏｃｋ等人对兔支气管黏膜结合淋巴组织（ＢＡＬＴ） ＊为通讯作者。 基金项目：江西省自然科学基金项目（２００７ＧＺＹ１００３）。 的结构和功能进行了研究；Ｆａｇｅｒｌａｎｄ和Ａｒｐ分别对火鸡和 鸡ＢＡＬＴ的结构和发育进行了研究，结果证明ＢＡＬＴ和 ＧＡＩ Ｔ结构十分相似，火鸡的ＢＡＬＴ分布在初级支气管及初 级支气管和次级支气管交界处；鸡的ＢＡＩ Ｔ分布在次级支气 管及其末端开口处。禽类的ＢＡＬＴ为缺少纤毛，有不规则微 绒毛的扁平上皮细胞，其表面有深凹陷，胞浆内溶酶体和内 脂网均少，顶部胞浆有许多空泡。淋巴组织的淋巴小结体积 和数量与日龄有关，淋巴组织中含有巨噬细胞和异嗜性白 细胞“ 。 １．３ 眼结膜相关淋巴组织（Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａ—Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ，ＣＡＬＴ） 近年来，人们开始对眼结膜集合淋巴组织（ＣＡＬＴ）进行 研究。猪的眼结膜上有ＣＡＬＴ，ＣＡＩ Ｔ主要集中在下眼睑结 膜穹隆处，上眼睑也有ＣＡＩ Ｔ，但淋巴小结数量少且分散，主 要集中在鼻泪管周围。研究表明，ＣＡＬＴ是眼鼻区重要的免 疫应答组织之一，协同某些腺体完成独特的局部免疫功能， 同时参与全身免疫应答的调控“ 。另外还有鼻咽相关淋巴 组织（Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｘ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ，ＮＡＩ Ｔ）、喉 淋巴相关淋巴组织（Ｌａｒｙｎｘ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ， ＬＡＬＴ），中耳腔、唾液腺、扁桃体等组织。 除了上述的黏膜相关淋巴组织（也称为集结淋巴组织， ｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）外，黏膜免疫系统中还有重要的分 散淋巴组织（ｄｉｆｆｕｓｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）。这是一种没有特定组 织结构的淋巴样细胞，它们分布在黏膜的组织间隙，游离于 上皮细胞或黏膜固有层（１ａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）的疏松结缔组织之 间。Ｔ细胞、Ｂ细胞、浆细胞是分散淋巴样组织中的主要细 胞成分，它们的相对数量在不同的黏膜表面会有所不同。在 胎儿期的黏膜表面几乎没有这些细胞，它们是在动物出生 后，随着对抗原暴露程度的增加而发展起来的。虽然分散淋 巴样组织不像集结淋巴样组织那样具有特异的组织结构，但 是它在黏膜免疫反应中也起着举足轻重的作用，例如抗原的 加工、处理和呈递，以及ＩｇＧ抗体的产生等。 ２黏膜免疫反应 黏膜免疫反应的过程大致如下：黏膜结合淋巴组织 （ＭＡＬＴ）与外界抗原接触后将抗原摄取，淋巴组织中的辅助 细胞提呈抗原，将组织中的Ｂ淋巴细胞和Ｔ淋巴细胞致敏。 致敏的Ｂ淋巴细胞、Ｔ淋巴细胞通过不同的淋巴管离开淋巴 组织，并通过胸导管进入血液循环，进而到达全身各处的黏 膜组织，在那里Ｂ淋巴细胞定居下来并分裂、增殖、成熟为 ＩｇＡ浆细胞 。 黏膜免疫反应中既有体液免疫，又有细胞免疫，两者以 体液免疫为主，体液免疫的主要抗体是ＩｇＡ（Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ＩｇＡ， Ｓ－ＩｇＡ），占黏膜组织所产生抗体的８ｏ 以上。ＩｇＡ在局部浆 《上海畜牧兽医通讯》２０１２年第５期 细胞内合成后，在上皮细胞的细胞膜内与分泌成分（Ｓｅｃｒｅｔｏ— ｒｙ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，ＳＣ）结合形成Ｓ—ＩｇＡ，通过上皮细胞的囊泡运 送释放人肠腔等黏膜表面。分泌物中的ＩｇＡ主要以二聚体 ・ １３ ・ 和实践的角度考虑，ＩｇＧ的水平不能真实反映疫苗的肠道保 护状况 。 对于肠道黏膜免疫来说，ＩｇＡ发挥至关重要的作用，其 抗体水平更能体现疫苗免疫保护情况，但由于黏膜免疫水平 （Ｓ－ＩｇＡ）的检测受到临床上的一些限制，目前国内还缺乏标 和四聚体形式存在（分别有４个和８个抗原结合部位），多聚 体比单体有更强的中和病毒的能力，多聚体的多价性比单体 对细胞的凝集作用更强。Ｓ－ＩｇＡ也中和其它抗原如细菌毒 素、酶等，Ｓ－ＩｇＡ对蛋白分解酶具有抵抗力，蛋白分解酶不能 将其分解。 除体液免疫外，黏膜免疫还有细胞免疫。包括细胞毒淋 巴细胞（ＣＴＬｓ）、ＡＤＣＣ和ＮＫ细胞。黏膜固有层内及ＭＡＬ 准的ＩｇＡ检测技术和产品，关于疫苗免疫后采用ＩｇＡ抗体水 平作为评判标准的报道较少。应用放射免疫（双抗体一ＰＧＥ 法）技术测定粪便中Ｓ－ＩｇＡ含量在人医已有报道 ”，南京农 业大学动物医学院杨倩等人也成功应用双抗夹心ＥＬＩＳＡ对 仔猪黄痢粪便与正常粪便的Ｓ－ＩｇＡ水平进行检测和比较，探 Ｔ中均含有细胞毒淋巴细胞，病毒感染细胞可被这些Ｔ细胞 所溶解。最近的研究表明，上皮内淋巴细胞（ＩＥＬ）在诱导和 调节黏膜免疫应答中起着重要作用。ＩＥＬ分为两个亚群，其 一具有抗原特异性细胞毒功能，其二具有ＮＫ功能，显示非 抗原特异性的溶解细胞能力 。在抵抗病原微生物入侵方 面，黏膜体液免疫及细胞免疫均发挥着十分重要的作用。 ３猪黏膜免疫系统的功能 黏膜免疫系统的主要功能是为机体提供黏膜表面的防 御作用，它包括非免疫保护和免疫保护两个方面。宿主黏膜 表面良好防御功能的保持有赖于非免疫保护作用和免疫应 答反应两者的健全和完整。非免疫保护包括：（１）常驻正常 菌群抑制潜在病菌的生长；（２）消化道蠕动和气管、支气管纤 毛上皮细胞的纤毛定向摆动，以减少潜在病菌与上皮细胞的 作用；（３）胃酸、胃胆盐的微环境不利于病菌生长；（４）黏膜上 皮细胞分泌的糖蛋白构成细胞膜的外被，称糖萼（ｇｌｙｃｏｃａ— ｌｙｘ）或细胞衣（ｃｅｌｌ ｃｏａｔ），在上皮表面与病菌间形成屏障；（５） 溶菌酶（１ｙｓｏｚｙｍｅ）、乳铁蛋白（１ａｅｔｏｆｅｒｒｉｎ）、乳过氧化物酶 （１ａｃｔ０ｐｅｒｏｉｄａｓｅ）对某些病菌有抑杀作用。黏膜免疫保护包 括体液免疫和细胞免疫 。 过去认为，猪体的免疫系统只存在着两种基本形式：细 胞免疫和体液免疫。但实际上除了以上两种形式之外，猪体 还有另外一种极其重要的免疫方式，那就是黏膜免疫。如果 黏膜免疫的能力下降，则猪同样会受到细菌和病毒等病原体 的侵害，导致疾病的发生。 猪的消化道、呼吸道、生殖道在体内占有很大的面积，这 些管道的黏膜表面是许多病原微生物进人机体的必经之路， 尤其是消化道疾病危害严重，不仅局限于消化道的损伤，还 可导致机体免疫力下降，容易继发其他疾病，因此黏膜免疫 对防止猪的传染病具有重要的地位０ 。猪体的口腔、鼻腔、 呼吸道、消化道以及泌尿生殖道的表面被黏膜组织所覆盖， 其表面积达４００ ｍ ，这些黏膜上存在着大量的免疫细胞，如 淋巴细胞和巨噬细胞等。实验证明，机体每天产生的免疫球 蛋白的８０ 被分泌到肠黏膜，２Ｏ 被分泌到呼吸道、胆囊壁 及尿道黏膜上。研究结果表明，９ｏ 以上的细菌、病毒和寄 生虫感染都起始于黏膜表面，黏膜表面的免疫细胞通过复杂 的作用，使致病菌的繁殖受到抑制，最终达到阻止病原体的 粘附和侵入的目的。 ４黏膜免疫系统的检测 免疫抗体水平是反映疫苗免疫效果的重要指标，也是疫 苗设计的重要参考依据。理想的抗体水平应该与疫苗的保 护率成正相关，但由于目前动物疫苗免疫抗体检测基本上都 集中在血液中ＩｇＧ抗体水平的检测，疫苗免疫后血清中ＩｇＧ 抗体水平很高但动物仍然发病的情况时常发生０ ，由此可 见，传统检测ＩｇＧ水平显然存在明显缺陷，从疫苗设计理论 索出了Ｓ－ＩｇＡ与仔猪黄痢病理过程的关系，为仔猪黄痢的防 制提供理论依据０ 。由此猪肠道黏膜免疫及检测方法的研 究对于预防动物传染性疾病的发生将发挥重要的作用，因此 目前迫切需要进行有关猪肠道黏膜免疫ＩｇＡ抗体检测方法 的研究，为肠道疫苗的设计及免疫效果评价提出新的评判标 准，并为其他黏膜免疫提供借鉴。 ５ 结语 疫苗免疫效果评价是疫苗研究的关键技术之一，也是疫 苗药证申报的技术瓶颈。猪肠道黏膜免疫与许多疾病有关， 建立猪肠道黏膜免疫ＩｇＡ抗体的标准检测方法，将为疫苗免 疫效果提供新的评价方法，对提高疫苗质量及建立新的疫苗 免疫保护评价体系起到至关重要作用，也将为相关生物制品 的发展提供重要技术支撑。因此，黏膜免疫及检测的研究任 重而道远，需要科学工作者的共同努力，同时随着科学技术 的不断发展，对于黏膜免疫及检测的研究将不断深入，并取 得更大的进展。 参考文献 （１３董玉兰，王树迎．动物黏膜免疫细胞研究进展．动物医学进展， ２００３，２４（１）：７～９． ［２］李富文．动物黏膜免疫系统．动物科学和动物医学，２００１，１８（６）： １７～１９． （３３张永振，徐建国．粘膜免疫系统和粘膜免疫应答的研究（Ｊ３．细胞 生物学杂志，２００１，（１）：１１～１６． ［４３孙斌。高齐瑜，等．鸡结膜结合淋巴组织（ＣＡＬＴ）对新城疫疫苗点 眼免疫应答［Ｊ］．畜牧兽医学报，１９９７，２８（３）：２４５～２５０． （５３ Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ 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