一种葡萄糖氧化酶制备技术[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 106591249 A(43)申请公布日 2017.04.26

(21)申请号 201611084871.1(22)申请日 2016.11.30

(71)申请人 温县兴发生物科技有限公司

地址 454850 河南省焦作市温县产业集聚

区鑫源一路中段(72)发明人 吴丽　安民　安庆堂　冯斌斌　(51)Int.Cl.

C12N 9/04(2006.01)C12R 1/685(2006.01)

权利要求书1页 说明书3页

CN 106591249 A(54)发明名称

一种葡萄糖氧化酶制备技术(57)摘要

本发明属于食品生物技术领域，具体公开了一种葡萄糖氧化酶制备技术，包括以下步骤：（1）菌株复壮：对保存的黑曲霉进行分离复壮，获得遗传稳定的黑曲霉菌株；（2）配制培养基：配制种子培养基及发酵培养基；（3）发酵控制：选定黑曲霉的最佳产酶条件，发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，发酵结束后获得葡萄糖氧化酶。本发明以黑曲霉为产酶菌株，经种子培养后进入发酵罐进行产酶发酵，发酵过程中通过添加细胞渗透剂使得葡萄糖氧化酶能够快速分泌到发酵液中，通过细胞渗透剂的加入可以有效提高发酵液中的单位酶活。本发明可有效降低葡萄糖氧化酶的生产成本，有利于葡萄糖氧化酶的工业化生产，同时也为酶法制备葡萄糖酸钠提供了低廉的酶制剂。

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权　利　要　求　书

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1.一种葡萄糖氧化酶制备技术，其特征是包括以下步骤：（1）菌株复壮：对保存的黑曲霉进行分离复壮，获得遗传稳定的黑曲霉菌株；（2）配制培养基：配制种子培养基及发酵培养基，种子培养基100mL中含：葡萄糖5g，KCl 0.02g，KH2PO4 0.02g，MgSO4 0.012g，（NH4） 0.06g，酵母浸粉 0.3g，大豆蛋白胨0.2g；2HPO4发酵培养基为葡萄糖172g/L，玉米浆 11 g/L，碳酸钙53 g/L，牛肉蛋白胨3.5 g/L，（NH4）

 0.5 g/L，KCl 0.15 g/L，MgSO4 0.125 g/L，FeSO4 0.125 g/L；2HPO4

（3）发酵控制：选定黑曲霉的最佳产酶条件，发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，发酵结束后获得葡萄糖氧化酶。

2.根据权利要求 1 所述的一种葡萄糖氧化酶制备技术，其特征是，所述步骤（2）中，种子培养基中还含低聚果糖0.01-0.05 g/L，玉米浆0.05-0.2 g/L；发酵培养基中还含低聚果糖0.1-0.2 g/L，玉米浆0.5-1.0 g/L。

3.根据权利要求 1 所述的一种葡萄糖氧化酶制备技术，其特征是，所述步骤（3）中，黑曲霉发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，细胞渗透剂的添加量符合方程式：y=3x3+6x2+x+2，其中y为细胞渗透剂添加量，x为发酵时间。

4.根据权利要求 1 所述的一种葡萄糖氧化酶制备技术，其特征是，所述步骤（3）中，细胞渗透剂为葡萄糖酸内酯或葡萄糖酸钠。

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一种葡萄糖氧化酶制备技术

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技术领域[0001]本发明属生物技术领域，具体涉及一种葡萄糖氧化酶制备技术。

背景技术[0002]葡萄糖氧化酶（简称GOD）能够在有氧气的条件下专一性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢，高纯度GOD的制剂为淡黄色粉末、易溶于水，完全不溶于乙醚、氯仿、甘油和乙二醇。50%丙酮、66%甲醇能使其沉淀。它广泛地分布于动物、植物和微生物体内，但由于微生物具有生长繁殖速度快，来源广等特点使之成为葡萄糖氧化酶的主要来源，微生物中的主要生产菌株为黑曲霉和青霉。葡萄糖氧化酶是用黑曲霉等发酵制得的一种需氧脱氢酶，对人体无毒、副作用，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等功能，它广泛应用于食品、饲料、医药等行业中，具有去除葡萄糖、脱氧、杀菌等作用。[0003]葡萄糖酸系列保健产品的传统的发酵生产工艺存在高污染高耗能，将逐步被酶法新工艺所取代。目前国内利用新工艺生产所需的葡萄糖氧化酶主要依靠进口，所以葡萄糖氧化酶的国产化将是新工艺普及的瓶颈所在。黑曲霉由于含有大量的葡萄糖氧化酶，故而能高效地将葡萄糖转化为葡萄糖酸，目前在葡萄糖酸的发酵生产中广泛使用黑曲霉作为发酵菌种。同样，黑曲霉也被用来发酵生产葡萄糖氧化酶，但是目前酶活普遍较低，多在2～7 U/mL。提高发酵液葡萄糖氧化酶酶活的新工艺亟待被解决。发明内容[0004]本发明的目的在于克服现有技术存在的发酵液葡萄糖氧化酶酶活低的现象，提供一种葡萄糖氧化酶制备技术。[0005]本发明所述的一种葡萄糖氧化酶制备技术，包括如下步骤：

（1）菌株复壮：对保存的黑曲霉进行分离复壮，获得遗传稳定的黑曲霉菌株；（2）配制培养基：配制种子培养基及发酵培养基，种子培养基100mL中含：葡萄糖5g，KCl 0.02g，KH2PO4 0.02g，MgSO4 0.012g，（NH4） 0.06g，酵母浸粉 0.3g，大豆蛋白胨0.2g；2HPO4发酵培养基为葡萄糖172g/L，玉米浆 11 g/L，碳酸钙53 g/L，牛肉蛋白胨3.5 g/L，（NH4）

 0.5 g/L，KCl 0.15 g/L，MgSO4 0.125 g/L，FeSO4 0.125 g/L；2HPO4

（3）发酵控制：选定黑曲霉的最佳产酶条件，发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，发酵结束后获得葡萄糖氧化酶。[0006]所述的一种葡萄糖氧化酶制备技术，其特征是，所述步骤（2）中，种子培养基中还含低聚果糖0.01-0.05 g/L，玉米浆0.05-0.2 g/L；发酵培养基中还含低聚果糖0.1-0.2 g/L，玉米浆0.5-1.0 g/L。[0007]所述的一种葡萄糖氧化酶制备技术，其特征是，所述步骤（3）中，黑曲霉发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，细胞渗透剂的添加量符合方程式：y=3x3+6x2+x+2，其中y为细胞渗透剂添加量，x为发酵时间。[0008]所述的一种葡萄糖氧化酶制备技术，其特征是，所述步骤（3）中，细胞渗透剂为葡

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萄糖酸内酯或葡萄糖酸钠。[0009]与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明是程序式添加细胞渗透剂。葡萄糖氧化酶的产生是一个曲线方程，细胞渗透剂的添加量根据该方程式进行添加，当酶分泌多的时候，细胞渗透剂的添加量也随之增多，当酶分泌少的时候，细胞渗透剂的添加量也随之减少。细胞渗透剂的添加可以再不损害细胞生物活性的同时，使得胞内酶得到释放，从而可以实现葡萄糖氧化酶的连续生产。该技术与国内现有技术相比，实现了酶的连续化生产，大大减少了生产废水，显著降低了生产成本，且工艺简单，酶活稳定性较高。具体实施方式[0010]以下提供本发明的一些实施例，以助于进一步理解本发明。[0011]实施例1

（1）对保存的黑曲霉进行分离复壮，获得遗传稳定的黑曲霉菌株；（2）配制种子培养基及发酵培养基，种子培养基100mL中含：葡萄糖5g，KCl 0.02g；KH2PO4 0.02g；MgSO4 0.012g，（NH4） 0.06g，酵母浸粉 0.3g，大豆蛋白胨0.2g。发酵培2HPO4养基为葡萄糖172g/L，玉米浆 11 g/L，碳酸钙53 g/L，牛肉蛋白胨3.5 g/L，（NH4） 0.5 2HPO4g/L，KCl 0.15 g/L，MgSO4 0.125 g/L，FeSO4 0.125 g/L。种子培养基中还含低聚果糖0.01 g/L，玉米浆0.05 g/L；发酵培养基中还含低聚果糖0.1 g/L，玉米浆0.5 g/L；

（3）选定黑曲霉的最佳产酶条件，发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，发酵结束后获得葡萄糖氧化酶。黑曲霉发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，细胞渗透剂的添加量符合方程式：y=3x3+6x2+x+2，其中y为细胞渗透剂添加量，x为发酵时间。其中细胞渗透剂为葡萄糖酸内酯。[0012]该发明条件下发酵液中葡萄糖氧化酶的酶活为300U/mL。[0013]实施例2

（1）对保存的黑曲霉进行分离复壮，获得遗传稳定的黑曲霉菌株；（2）配制种子培养基及发酵培养基，种子培养基100mL中含：葡萄糖5g，KCl 0.02g，KH2PO4 0.02g，MgSO4 0.012g，（NH4） 0.06g，酵母浸粉 0.3g，大豆蛋白胨0.2g。发酵培2HPO4养基为葡萄糖172g/L，玉米浆 11 g/L，碳酸钙53 g/L，牛肉蛋白胨3.5 g/L，（NH4） 0.5 2HPO4g/L，KCl 0.15 g/L，MgSO4 0.125 g/L，FeSO4 0.125 g/L。种子培养基中还含低聚果糖0.03 g/L，玉米浆0.1 g/L；发酵培养基中还含低聚果糖0.15 g/L，玉米浆0.8 g/L；

（3）选定黑曲霉的最佳产酶条件，发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，发酵结束后获得葡萄糖氧化酶。黑曲霉发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，细胞渗透剂的添加量符合方程式：y=3x3+6x2+x+2，其中y为细胞渗透剂添加量，x为发酵时间。细胞渗透剂为葡萄糖酸内酯。[0014]该发明条件下发酵液中葡萄糖氧化酶的酶活为500U/mL。[0015]实施例3

（1）对保存的黑曲霉进行分离复壮，获得遗传稳定的黑曲霉菌株；（2）配制种子培养基及发酵培养基，种子培养基100mL中含：葡萄糖5g，KCl 0.02g，KH2PO4 0.02g，MgSO4 0.012g，（NH4） 0.06g，酵母浸粉 0.3g，大豆蛋白胨0.2g。发酵培2HPO4养基为葡萄糖172g/L，玉米浆 11 g/L，碳酸钙53 g/L，牛肉蛋白胨3.5 g/L，（NH4） 0.5 2HPO4

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g/L，KCl 0.15 g/L，MgSO4 0.125 g/L，FeSO4 0.125 g/L。种子培养基中还含低聚果糖0.05 g/L，玉米浆0.2 g/L；发酵培养基中还含低聚果糖0.2 g/L，玉米浆1.0 g/L；

（3）选定黑曲霉的最佳产酶条件，发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，发酵结束后获得葡萄糖氧化酶。黑曲霉发酵过程中程序式添加细胞渗透剂，细胞渗透剂的添加量符合方程式：y=3x3+6x2+x+2，其中y为细胞渗透剂添加量，x为发酵时间。其中细胞渗透剂为葡萄糖酸钠。[0016]该发明条件下发酵液中葡萄糖氧化酶的酶活为800U/mL。

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