[12]发明专利申请公开说明书
[21]申请号99814748.6
[51]Int.CI7
C12P 19/18C08B 37/00A61K 9/20
// ( C12P19/18,C12R1:36)
[43]公开日2002年2月27日[22]申请日99.11.30
[21]申请号99814748.6
[11]公开号CN 1338002A
[74]专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标
事务所
代理人郭建新
[30]优先权
[32]1998.12.28 [33]DE [31]19860376.2[86]国际申请PCT/EP99/09299 1999.11.30[87]国际公布WO00/39321 DE 2000.07.06[85]进入国家阶段日期
2001.06.19
[71]申请人人造丝投资有限公司
地址德国法兰克福
[72]发明人M·维斯穆勒 M·克安兹 N·普罗瓦特
权利要求书 1 页 说明书 12 页 附图 2 页
[54]发明名称
包含α－1,4－葡聚糖链的多糖及其制备方法[57]摘要
本发明涉及一种生产多糖的方法,该多糖包含α－1,4－葡聚糖链。根据本发明的方法,在有淀粉蔗糖酶的情况下,通过用蔗糖转化起反应,而使葡糖基受体经历键延伸反应。以这种方式来选择反应混合物中葡糖基受体的量,即葡糖基受体的有效末端对蔗糖的摩尔比至少为1∶1,000和/或葡糖基受体对蔗糖的重量比至少为1∶50。
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权 利 要 求 书
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1.一种制备包含α-1，4-葡聚糖链的多糖的方法，包括在有淀粉蔗糖酶的情况下，通过与蔗糖反应而使葡糖基受体经历键延伸反应，选择反应混合物中葡糖基受体的量，以使用于键延伸的葡糖基受体末端对蔗糖的摩尔比至少为1∶1000和/或葡糖基受体对蔗糖的重量比至少为1∶50。
2.如权利要求1所要求的方法，其中用于键延伸的葡糖基受体末端对蔗糖的摩尔比至少为5∶1000，优选至少为1∶100。 3.如权利要求1或2中任何一项所要求的方法，其中将果糖加入到反应混合物中。
4.一种制备包含α-1，4-葡聚糖链的多糖的方法，包括在有淀粉蔗糖酶且加入果糖的情况下，通过与蔗糖反应而使葡糖基受体经历键延伸反应。
5.如权利要求3或4中任何一项所要求的方法，其中在至少10mM的浓度时，将果糖加入到反应混合物中。
6.如权利要求3至5中任何一项所要求的方法，其中在至少50mM，优选100-800mM的浓度时，将果糖加入到反应混合物中。 7.如权利要求1至6中任何一项所要求的方法，其中所使用的淀粉蔗糖酶是源自奈瑟氏球菌属细菌的淀粉蔗糖酶。
8.如权利要求7所要求的方法，其中所使用的淀粉蔗糖酶是源自多糖奈瑟氏球菌菌种的细菌的淀粉蔗糖酶。
9.如权利要求1至8中任何一项所要求的方法，其中所使用的葡糖基受体是糊精，直链淀粉，支链淀粉或糖原。
10.权利要求1至9中任何一项所要求的方法在多糖制备过程中用于控制分子量的用途。
11.一种用权利要求1至9中任何一项所要求的方法得到的包含α-1，4-葡聚糖-链的多糖。
12.权利要求11所要求的包含α-1，4-葡聚糖链的多糖作为片剂填充剂的用途。
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说 明 书
包含α-1，4-葡聚糖链的多糖及其制备方法
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本发明涉及包含α-1，4-葡聚糖链的多糖及其制备方法。
多糖是由大量糖苷结合的单糖组成的聚合物。多糖存在于高等生物体和微生物体如细菌中，并且实现，例如，贮藏和构架物质的作用。多糖用于商业上，特别是在食品业、轻工业、卫生保健和分析中作为辅剂和添加剂。
葡聚糖是由葡萄糖单体单独组成的多糖。在α-1，4-葡聚糖中，这些葡糖基通过α-1，4-糖苷键相互连接。α-1，4-葡聚糖，由于其物理化学性能，可用于生产无色、无臭无味、无毒和生物可降解的薄膜。这种薄膜已经大量的应用在，例如食品业、纺织业和玻璃纤维业中。 最常见的天然α-1，4-葡聚糖是直链淀粉，一种淀粉的组成部分。直链淀粉已经用于生产纤维，该纤维的性能类似天然纤维素纤维的性能，且使其在造纸中的部分或全部替换成为可能。在制药业中，直链淀粉作为片剂、糊剂的填充剂以及皮肤保护物质的添加剂使用。在食品业中，它作为布丁、汤、沙司、蛋黄酱、奶油夹心的增稠剂和粘合剂，以及明胶的代用品。直链淀粉还在隔音墙板的生产中作为粘合剂使用。
支链淀粉，即淀粉的主要组成部分，和糖原是另外的多糖，该多糖的主链是由具有α-1，4-糖苷键的葡糖基组成的。这些多糖具有经由α-1，6-糖苷键连接到主链上的侧链。这些多糖也可以在工业中较大范围地使用。
α-1，4-葡聚糖的分离，如淀粉和糖原从植物和动物生物体中的分离是复杂和昂贵的，且不能总是产生具有再现性能的产品。因为这个原因，能够生产出这类葡聚糖的细菌日益变成注意的目标。
在多数细菌中，多糖是经由核苷酸活化的糖，以类似于高等生物体中的方式合成。因此，在多数细菌中，糖原的生物合成包含三种酶，
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也就是说，ADP-葡萄糖磷酸化酶，它催化由葡糖-1-磷酸和ATP形成ADP-葡萄糖；糖原合酶，它将葡萄糖从ADP-葡萄糖转移到生长的葡聚糖链上；以及分支酶，它将α-1，6-键引入到线形α-1，4-葡聚糖链中。然而，在某些细菌中，多糖的合成也可以在没有活化糖参与的情况下进行。
已经在奈瑟氏球菌属(Neisseria)的细菌中发现一种细菌系统，其可以在没有核苷酸糖参与的情况下合成多糖。在这些细菌中，具有类似于糖原的结构的多糖是通过淀粉蔗糖酶直接从蔗糖，即该酶的天然底物[Okada，G.，和E.J.Hehre，J.Biol.Chem.249：126-135(1974)；MacKenzie，C.R.等，Can.J.Microbiol.23：1303-1307(1977)；MacKenzie，C.R.等，Can.J.Microbiol.24：357-362(1978)]合成的。
根据下列反应方程式，淀粉蔗糖酶(蔗糖：1，4-α-葡聚糖 4-α-葡糖基转移酶，E.C.2.4.1.4.)通过转移蔗糖分子中的葡糖基至生长的聚合物链上，释放D-果糖，来催化α-1，4-糖苷连接的葡聚糖的形成。
蔗糖+(α-1，4-D-葡糖基)n→D-果糖+(α-1，4-D-葡糖基)n+1
在这个反应中不需要核苷酸活化的糖或辅因子。然而，通过葡糖基受体(或引物)例如寡糖和多糖如直链淀粉或糖原的存在来刺激酶，根据上面的反应方程式，用α-1，4-葡聚糖键延伸[Okada，G.，和E.J.Hehre，J.Biol.Chem.249：126-135(1974)；Remaud-Simeon，M.等，In S.B.Petersen，B.Svenson和S.Pedersen(编者)，Carbohydrate
bioengineering，pp.313-320(1995)；Elsevier Science B.V.，Amsterdam，Netherlands]来转移蔗糖的葡糖基。
迄今，人们仅仅在奈瑟氏球菌属的细菌中发现了淀粉蔗糖酶。在细菌中组成型表达的该酶是非常稳定的且很稳固地结合在其聚合产物上。在多数已经研究过的种中，该酶是在胞内定位的，但是在多糖奈瑟氏球菌(Neisseria polysaccharea)中，淀粉蔗糖酶被分泌出。在这期间，已经将源自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶的基因分离并使用遗传工程方法来表达。人们已经发现该酶很可能只催化线形α-1，4-
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葡聚糖链的形成(WO95/31553)。
源自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶用于制备线形α-1，4-葡聚糖的用途已经在WO95/31553中提出。然而，在淀粉蔗糖酶用于生产多糖的用途中存在一个问题，即通常在有淀粉蔗糖酶存在的情况下形成的多糖具有高度变化的分子量，即高的多分散性或宽的分子量分布。然而，对于工业应用，由于其更加均一的物理化学性能，期望多糖制品具有尽可能均一的分子量，也就是说，低的多分散性。
因此，本发明的目的是提供具有低的多分散性的包含α-1，4-葡聚糖链的多糖。
此目的是通过权利要求书中描述的方法和多糖来达到的。
因此，本发明涉及一种方法，包括在有淀粉蔗糖酶的情况下，通过与蔗糖反应而使葡糖基受体经历键延伸反应，选择反应混合物中葡糖基受体的量，以便使用于键延伸的葡糖基受体末端对蔗糖的摩尔比至少为1∶1000和/或葡糖基受体对蔗糖的重量比至少为1∶50。 本发明还涉及一种方法，包括在有淀粉蔗糖酶且加入果糖的情况下，通过与蔗糖反应而使葡糖基受体经历键延伸反应。
通过这些方法得到的包含α-1，4-葡聚糖链的多糖也是本发明的主题。
创造性使用的葡糖基受体是这类化合物，即，α-1，4-葡聚糖链在其上的合成(即α-1，4-葡聚糖链的伸长)可以在源自蔗糖的α-D-葡糖基的淀粉蔗糖酶催化转移下进行。适宜的葡糖基受体特别是具有末端葡糖基的短链和长链的寡糖和多糖，该末端葡糖基经由α-1，4-糖苷键连接。优选地，创造性使用的葡糖基受体是非分支的，特别优选分支的、寡糖或多糖。创造性葡糖基受体的实施例是麦芽寡糖如麦芽戊糖，麦芽己糖或麦芽庚糖。
优选的葡糖基受体是糊精，支链淀粉，直链淀粉和直链淀粉样多糖，例如源自玉米和马铃薯的，以及糖原及糖原样多糖，例如源自肌肉组织，贝类或细菌的。
特别优选的葡糖基受体是分支的多糖，如糖原。这类分支的葡糖基
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受体具有不止一个可以在该处进行键延伸的末端。因此糖原链具有大约7-12％可以将葡糖基转移至此的分支。
现已出乎意料地发现，如果在反应混合物中，用于键延伸的葡糖基受体末端对蔗糖的摩尔比和/或葡糖基受体对蔗糖的重量比取一规定的最小值，那么在α-1，4-葡聚糖的淀粉蔗糖酶催化的合成中，可以获得具有低的多分散性的多糖。较之导致高的多分散性的多糖制品的副反应，认为键延伸反应在此最小值时是优选的。在恒定的蔗糖浓度下，随着受体浓度的增加，多分散性表现出减小的趋势。
适宜地，在反应混合物中，用于键延伸的葡糖基受体末端对蔗糖的摩尔比至少为1∶1000。优选地，摩尔比至少为5∶1000，特别优选至少为1∶100。用于键延伸的葡糖基受体末端对蔗糖的摩尔比的上限不是非常关键的，适宜地大约为1∶50-1∶25。
葡糖基受体对蔗糖的重量比适宜地至少为1∶50，例如至少为2∶50，或至少为5∶50。最佳重量比取决于受体的类型。就分支多糖受体来说，在给定的蔗糖浓度下，反应混合物中所需要的受体的量通常低于非分支或仅仅轻微分支的多糖受体的情况。因此，当使用具有大约160000g/mol的重均分子量Mw的糖原时，证明至少2.5∶50的受体对蔗糖比是有利的，而就具有大约5000-6000g/mol的Mw的糊精来说，至少5∶50-10∶50的受体对蔗糖重量比是优选的。
对于给定的蔗糖浓度和给定的葡糖基受体来说，通过本发明方法得到的多糖的分子量越低，则所选择的葡糖基受体的浓度越高。以这种方式，通过葡糖基受体对蔗糖重量比的适宜选择，也可以控制终产物的分子量。
在反应混合物中，作为淀粉蔗糖酶底物使用的蔗糖的绝对浓度不是关键性的。然而，所使用的量，适宜地不超过50％(w/v)，因为，超过这个浓度，溶液的粘度太高且反应速率急剧减小。优选地，反应混合物中的蔗糖浓度在1-30％(w/v)之间。
键延伸反应的最佳条件，例如反应混合物中，用于键延伸的葡糖基受体末端对蔗糖的摩尔比，葡糖基受体对蔗糖的重量比以及蔗糖的浓
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度，可以通过简单的实验毫无问题地确定。
人们已经进一步发现，在α-1，4-葡聚糖的淀粉蔗糖酶催化合成中，向反应混合物中加入果糖时可以获得具有低的多分散性的多糖。大概，果糖的加入抑制了导致高多分散性多糖制品的干扰性副反应。无论葡糖基受体对蔗糖的摩尔比和重量比是否具有上面规定的最小值，均独立地观察到果糖的存在所引入的效果。果糖的加入导致更窄的分子量分布，即所得终产物的较小的多分散性，但是作为交换，产量稍微低一些。
适宜地，在至少10mM的浓度下，向反应混合物中加入果糖。优选地，在至少50mM，优选100-800mM的浓度下加入果糖。
通过本发明的方法，所使用的葡糖基受体的分子量可以增加至两倍到三倍，而毫无问题。因此，本发明的方法中所使用的受体的分子量也取决于终产物所期望的分子量。因为随着受体聚合程度的增加，键延伸反应的反应速率也增加，适宜地，然而，使用具有至少0.5×10g/mol，优选至少4×10g/mol，特别优选至少1×10-1×10g/mol的重均分子量Mw的受体。因为所用受体材料的均一性也减小了所得反应产物的多分散性，因而使用具有最低的可能多分散性的受体分子也是合理的。
能够作为淀粉蔗糖酶使用的所有酶可以，根据反应方程式 蔗糖＋((α-1，4-D-葡糖基)n→D-果糖＋(α-1，4-D-葡糖基)n+1 转移蔗糖分子的葡糖基至受体分子，释放D-果糖并形成α-1，4-葡聚糖链。优选地，使用源自原核生物的淀粉蔗糖酶，特别是源自奈瑟氏球菌属细菌的。适宜的淀粉蔗糖酶是那些存在于，例如，细菌菌种干燥奈瑟氏球菌，狗奈瑟氏球菌，灰色奈瑟氏球菌，深黄奈瑟氏球菌，微黄奈瑟氏球菌，反硝化奈瑟氏球菌和多糖奈瑟氏球菌中的。优选地，使用源自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶，例如源自多糖奈瑟氏球菌ATCC 43768的。
所使用的淀粉蔗糖酶可以从生物体中直接分离，在所述生物体中它们是天然合成的(MacKenzie，C.R.等.，Can.J.Microbiol.，
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24：357-362；1978)，或者，象WO95/31553中描述的，可以通过遗传工程方法生产它们(重组淀粉蔗糖酶)。也可以使用体外转录和翻译系统在无细胞条件下生产该酶。
淀粉蔗糖酶不仅可以以粗制酶或部分纯化的形式使用，还可以以高度纯化的形式使用。优选地，使用高度纯化的淀粉蔗糖酶。术语“高度纯化的淀粉蔗糖酶”特别是指具有至少80％，优选至少90％，特别优选至少95％纯度的淀粉蔗糖酶。
本发明方法中高度纯化的淀粉蔗糖酶的使用所具有的优点是，酶不包含菌株残余物，例如微生物，而酶就是从其中分离出来的。例如，高度纯化的制品不包含其他不希望有的酶，例如多糖降解酶如淀粉酶。高度纯化的淀粉蔗糖酶对于在食品工业和制药工业中的使用也是有利的，因为规定的且没有不必要组分的反应介质也可以提供一个更加准确规定的产品。对于这些食品工业和制药工业中生物技术生产的产品，这会产生不那么复杂的授权方法，特别是如果这些产品不打算具有任何痕量的转基因微生物。
优选地，重组淀粉蔗糖酶按照，例如，WO95/31553中的描述使用。相对于天然存在的淀粉蔗糖酶，可以将这类重组淀粉蔗糖酶遗传修饰，如果适当的话，再通过突变，例如插入、缺失和替代，以便修饰被表达蛋白质的规定性能。因此，淀粉蔗糖酶可以，例如，与一种多肽序列一起作为融合蛋白表达，所述多肽序列的特异结合性能可以使融合蛋白更加容易分离，例如通过亲合色谱法(见，例如，Hopp
等，Bio/Technology 6(1988)，1204-1210；Sassenfeld，Trends Biotechnol.8(1980)，88-93)。特别优选，使用被宿主细胞分泌到营养培养基中的淀粉蔗糖酶，这样细胞消化和酶的进一步纯化就不必要了，因为分泌的酶可以从上清液中获得。正如多糖奈瑟氏球菌的情况下，淀粉蔗糖酶可被天然分泌，或者可以通过与一种信号肽一起表达的酶实现分泌，借助于该信号肽帮助，酶可以穿过宿主生物体的细胞膜。
淀粉蔗糖酶可以游离形式使用或固定在支持材料上。淀粉蔗糖酶的
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固定化提供了有利条件，即酶可以从反应介质中以简单的方式回收并重复使用。因为酶的纯化通常是昂贵而耗时的，酶的固定化和再利用使显著降低成本成为可能。另一优点是反应产品的纯度，其不含有蛋白质残余物。适宜的支持材料是，例如，琼脂糖，藻酸盐，纤维素，聚丙烯酰胺，二氧化硅或尼龙，经由共价键或非共价键连接到支持材料上。
所使用的淀粉蔗糖酶的量通常在0.1-100U/ml之间，优选在1-50U/ml之间，特别优选在2-25U/ml之间。
本发明的多糖适宜在体外的非缓冲或缓冲的含水系统中制备，该含水系统具有4-9之间的pH，优选在5.5-7.5之间。适宜的缓冲系统是，例如，柠檬酸盐缓冲液，马来酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液。 反应温度适宜在10-60℃之间，优选在25-45℃之间。
适宜地，反应进行至蔗糖完全转化。通常，对此的反应时间在1-150小时之间，例如10-100小时之间。
本发明形成的多糖常常微溶于水且可以因此毫无困难地从反应混合物中分离出来，例如通过离心。可以分离水溶性或部分水溶性多糖，例如通过用乙醇沉淀或通过冻干。
本发明的方法使低多分散性的包含α-1，4-葡聚糖链的多糖的简单且便宜的制备成为可能。该方法是以终产物分子量的简单可控性和显著的再现性为特征的。这使得制备恒定的均一性和纯度并由此而高质量的产品成为可能，其对进一步的工业用途来说是非常重要的。所得产物可以很便宜地加工，因为加工所需要的方法参数不需要针对每一加工批次进行重新优化。 附图描述：
图1表示作为葡糖基受体的糖原与蔗糖在有淀粉蔗糖酶参与的反应中，包含α-1，4-葡聚糖链的多糖的分子量分布，它是糖原浓度和蔗糖浓度的函数。
图2a表示糖原与蔗糖在有淀粉蔗糖酶参与，且有或没有果糖参与的反应中，包含α-1，4-葡聚糖链的多糖的分子量分布，它是糖原浓
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度和蔗糖浓度的函数。
图2b表示糊精与蔗糖在有淀粉蔗糖酶参与，且有或没有果糖参与的反应中，包含α-1，4-葡聚糖链的多糖的分子量分布，它是糊精浓度和蔗糖浓度的函数。
通过下面的实施例更加详细地描述本发明。 实施例1：淀粉蔗糖酶的纯化
为了生产淀粉蔗糖酶，使用大肠杆菌细胞，该细胞已经用载体pNB2转化，而该载体pNB2包含源自多糖奈瑟氏球菌(WO95/31553)的淀粉蔗糖酶。
离心这些大肠杆菌细胞的过夜培养物，这些大肠杆菌细胞可以分泌源自多糖奈瑟氏球菌的淀粉蔗糖酶，在大约1/20体积的50mM柠檬酸钠缓冲液(pH6.5)，10mM DTT(二硫苏糖醇)，1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)中重悬浮该细胞。在16000psi下使用弗氏压碎器将细胞粉碎两次。然后在12.5单位/ml的最终浓度下，将1mM的MgCl2和
benzonase(Merck；100000单位；250单位μl)加入到细胞提取物中。然后37℃轻度搅拌下，培养混合物至少30分钟。使提取物在冰上保持至少1.5小时。然后在大约40000g下离心30分钟，直到上清液较清澈。经由具有0.45μm孔径的PVDF膜(Millipore“Durapore”，或类似物)进行预过滤。使提取物在4℃时保持整夜。为进行疏水相互作用(HI)色谱法，将固体NaCl加入到提取物中且将NaCl调整为2M的浓度。在4℃和大约40000g下，再次离心混合物30分钟。然后通过具有0.22μm孔径的PVDF膜(Millipore“Durapore”，或类似物)过滤而将提取物从大肠杆菌的最终残留物中分离出来。将已经过滤的提取物在丁基琼脂糖-4B柱(Pharmacia)(柱体积：93ml，长：17.5cm)上分离。将大约50ml提取物加入到柱上，该提取物具有1-5单位-1的淀粉蔗糖酶活性。然后用150ml的缓冲液B(缓冲液B；50mM柠檬酸钠pH6.5，2M NaCl)将非结合蛋白从柱上洗下来。然后用渐小
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的线性NaCl梯度(在50mM柠檬酸钠，433ml体积，1.5ml min流速的条件下，从2M-OM的NaCl)洗脱淀粉蔗糖酶，其是使用自动泵系统(FPLC，Pharmacia)形成的。在0.7M-0.1M NaCl之间洗脱淀粉蔗糖酶。收集各个级分，经由PD10-Sephadex柱(Pharmacia)脱盐，用8.7％的甘油固定，测试淀粉蔗糖酶的活性并在贮藏缓冲液(8.7％的甘油，50mM的柠檬酸盐)中冷冻。 实施例2：淀粉蔗糖酶活性的测定
在各种稀释度下，将纯化蛋白或粗制蛋白提取物加入到1ml测定溶液中，该测定溶液包含5％蔗糖，0.1％糖原和100mM柠檬酸盐，pH6.5，并在37℃时培养。在5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，25分钟和30分钟之后，每次均从此测定溶液中取出100μl，并通过在95℃直接加热10分钟而使淀粉蔗糖酶的酶活性终止。使用偶联酶实验，光度测定(M.Stitt等，Methods in Enzymology 174：518-552；1989)通过淀粉蔗糖酶从蔗糖中释放出的果糖的量。为此，将1μl-10μl的灭活样品加入到1ml的pH6.9的50mM咪唑缓冲液，2mM MgCl2，1mM ATP，0.4mM NAD和0.5U/ml己糖激酶中。在连续加入葡糖-6-磷酸脱氢酶(得自Leukonostoc mesenteroides)和磷酸葡糖异构酶后，测量340nm处吸收的变化。然后用Lambert-Beer定律计算释放的葡萄糖的量。如果得到的结果与取样的时间点有关，那么可以测定酶单位U的数量。 在上述条件下，将1U定义为每分钟释放1μmol果糖的淀粉蔗糖酶的量。 实施例3：多糖的制备
3.1为了制备多糖制品，37℃下，用不同浓度的糖原(Merck；Mw160 000，多分散性大约为1.4)作为葡糖基受体，蔗糖作为底物，培养存在于10ml 0.1M醋酸钠缓冲液，pH6.5，0.02％叠氮化钠中的淀粉蔗糖酶，
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直到蔗糖完全转化，即，至少48小时。在5-20U/ml的浓度下加入淀粉蔗糖酶。在另外的相同条件下处理没有糖原的平行对照样品。 将沉淀的多糖离心(15分钟，1200g)，并通过在水中重悬浮而洗涤两次，并重复离心。在-20℃冷冻沉淀物，并在0.34mbar和25℃的室温(Alpha 1.4冷冻干燥器，Christ)下冻干。干燥过程中的样品温度为-25℃。
通过凝胶渗透色谱法(GPC)分析所得的产物。
按照DIN 55672-1中的规定进行操作。所有的测量均是使用0.09MNaNO3作为洗脱剂在二甲基亚砜(DMSO)中进行的。GPC使用了PS凝胶柱(10，10和10
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；得自PSS，Mainz，“SDV 10μ”型)的柱组合。
对于质量分率的检测，使用得自Shodex，“RI 71”型的差示折光计。使用得自Bischoff，“HPLC Compact Pump”型的泵。流速是1ml/min。使用得自PSS，Mainz的线形支链淀粉校准。(因为样品具有分支结构，测量的结果不是绝对的，而是相对的大小，然而，在恒定的样品分支程度内是可比较的)。得自PSS“Win-GPC scientific 4.02”的GPC软件完全依照DIN 55672-1且完全有效。因此，数据处理步骤的正确性是不依赖于系统而可再现的。数值小于1000g/mol的摩尔质量在评估中没有考虑。
结果列于下表且在图1中图解说明(wi和WI代表第i个聚合物级分的归一化的和相对的质量分率)。垂直的虚线表示作为葡糖基受体使用的糖原的初始分子量。
结果表明所得多糖的多分散性随着恒定的蔗糖浓度和逐渐增加的糖原浓度而急剧减小。
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表
蔗糖(％)
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糖原 5 10 20 40mg/ml Mw Mn In Mw Mn In Mw Mn In Mw Mn In0 67170 2129 32 7248 1953 3,7 4210 1215 3,5 2082 924 2,31 224400 17460 13 101700 7894 13 11250 2811 42，5 251400 28080 9 95670 4701 20
5 315300 71650 4,4 248500 24785 10,7 11330010 303500 235600 1,3 316900 76380 4,1 247900 12380 20 20 244100 195600 1,3 317000 243600 1,3 319400 40560 7,9 Mw 重均分子量Mn 数均分子量In 多分散性(Mw/Mn)
3.2在更进一步的试验中，37℃下，有果糖(初始浓度400mM)或没有果糖参与的情况下，用各种浓度的糖原，培养存在于10ml的0.1M醋酸钠缓冲液，pH6.5，0.02％叠氮化钠，5％蔗糖(w/v)中的淀粉蔗糖酶(5U/ml)，至蔗糖完全转化(至少48小时)。在其它方面相同的条件下处理没有酶的平行对照样品。象3.1中描述的那样，离心、洗涤、冷冻干燥并用GPC分析所得的多糖产物。结果在图2a中图解说明，其中Wi具有上述含义。垂直虚线表示作为葡糖基受体使用的糖原的初始分子量。
结果表明，所得多糖的多分散性随着恒定的蔗糖浓度和逐渐增加的糖原浓度而减小。在有果糖参与的情况下，观察到多分散性的进一步减小。
3.3在相同的条件下重复3.2中描述的试验，但是使用糊精(SigmaNo.D-4894，IV型，得自马铃薯，Mw6 650)替换糖原。在有果糖或没
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5580 21,5200700 5069 40277800 20090 14 99814748.6
有果糖参与的情况下，37℃培养至蔗糖完全转化(至少48小时)后，象上面描述的那样，离心、洗涤并冷冻干燥所得的多糖。对没有酶的平行对照样品在其它方面相同的条件下处进行理，并按照上面描述的那样进行加工和分析。结果在图2中图解说明，其中WI具有上述含义。垂直虚线表示作为葡糖基受体使用的糊精的初始分子量。
结果表明，所得多糖的多分散性随着恒定的蔗糖浓度和逐渐增加的糊精浓度而减小。在有果糖参与的情况下，观察到多分散性的进一说 明 书 第12/12页
步减小。
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图1
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图2
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