(完整word版)细菌的常用染色技术

细菌的常用染色技术

简单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。例如番红。

1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀,涂成极薄的菌膜。

2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。

3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面,以不烫手为宜）。

4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液（或石炭酸复红液),染l～2min.

5．水洗:用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6．干燥

7．镜检

复染色：利用用两种以上染料对细菌进行染色。例如革兰氏染色法。

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，需要碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂(decolorising agent）和复染液（counterstain).

碱性染料初染液的象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力,即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘(iodine )是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色,不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染

液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，而且将细胞区分成G+和G—两大类群，常用的复染液为番红。

1。载玻片固定.在无菌操作条件下，用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

2.草酸铵结晶紫染1分钟。

3.自来水冲洗,去掉浮色。

4。用碘—碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液.

5。用中性脱色剂如乙醇(95%）或丙酮酸脱色30秒,革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。

6。用番红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色,革兰氏阴性菌则呈现红色。

细菌的染色及形态观察

一、目的要求

1、了解细菌染色的基本原理。

2、掌握细菌的简单染、革兰氏染色及其他染色方法。

3、观察和识别细菌的形态及细菌细胞的特殊结构。

二、实验说明

细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大,便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同,因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。

用于细菌染色的染色剂是苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。发色基团使化合物本身具有染色之能力,助色基团有电离特性，可以于被染物结合,使被染物着色。

染色剂有三种:酸性染色剂（电离后分子带负电荷)；碱性染色剂（电离后分子带电荷）；复合染色剂（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）。酸性染色剂主要用于染细胞质;碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构;复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次氏体。

三、实验材料

1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。

2、酒精灯、接种环、载玻片。

3、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、荚膜染色液、鞭毛染色液（配方见附录)。

四、方法步骤

(一）简单染色法

步骤：涂片 → 干燥 → 固定 → 染色 → 水洗 → 干燥

镜检。

1、涂片 在干净的载玻片加一滴蒸馏水，以无菌操作法，从斜面上挑取少量菌种,在载玻片上和水混合

后，涂成一均匀薄层。

2、干燥固定 涂片让其在空气中自然干燥，有时为使其干燥得快点，也可在酒精灯上加温，但勿贤紧靠火焰。

3、固定 待涂片干燥徨,手持载玻片一端,有菌膜的一面向上,在酒精灯火焰上通过几次（用手背触载玻片背面，以不烫手为宜），待冷却后，再加染料.

4、染色 玻片置于水平位置。加石炭酸复红液于菌膜部位。染1-2min。

5、水洗 倾去染液，斜置玻片，用很细水流的自来水冲洗(切勿使水流直接冲刷在菌膜处），直至洗下水呈无色为止。

6、干燥 自然干燥或用吸水纸吸干.

7、镜检。

（二）革兰氏染色法

步骤：涂片 → 干燥 → 固定 → 结晶紫染色 → 水洗 → 吸干 → 95%酒精脱色 → 水洗 → 吸干 → 蕃红复染 → 水洗 → 干燥 → 镜检。

1、涂片 同简单染色法

2、干燥 同简单染色法。

3、固定 同简单染色法。

4、用草酸结晶紫染色1min后水洗。

5、加碘液媒染1min。

6、水洗。

7、用95％酒精脱色，直至流下的酒精不呈紫色即停止（大约半分钟）立即水洗。

８、复染 滴加蕃红染液复染1min。

９、水洗。

10、干燥。

11、镜检。

（三）特殊染色法

1、芽孢染色法 芽孢壁较厚，透性低，着色和脱色均较困难,因此,芽孢染色需加热，并用着色力强的染料。

步骤：涂片 → 固定 → 孔雀绿染色 → 水洗 → 干燥 → 观察。

1、涂片 取一载片，将枯草杆菌以无菌操作涂片。

2、干燥 同简单染色法。

3、固定 同简单染色法。

4、加孔雀绿染液于涂片上,在火焰上加热直至有蒸气时开始计算时间，维持3—5min。加热时要随时添加染色液，切片让标本干涸。

5、水洗 待玻片冷却后，用自来水水洗。

6、复染 加蕃红液复染1—2min。

7、水洗 干燥。

8、镜检。

结果:芽孢呈绿色，芽孢周围的菌体呈红色。

2、荚膜染色法(用固氮菌或肺炎双球菌）

步骤：

1、在载片一端滴一滴自来水，取菌体置于其中。取一滴墨法与菌悬液混合,并且用另一载片之一端，将此水滴在载片上刮成薄膜，风干.

2、用纯甲醇固家1min。

3、加0.5％蕃红液数滴于涂片上冲去甲醇，并染色30S，然后倾去染液，立即吸干，镜检。

结果：背景黑色、荚膜无色，细胞红色.

3、鞭毛染色法(用荧光假单细胞或普通变形菌）细菌鞭毛极为纤细，在普通光学显微镜下不能看到， 只有用特殊的染色方法，才能把鞭毛显示出来。鞭毛染色的方法很多,但主要原理都是采取不稳定的胶体溶液做媒染

剂，使在鞭毛上生成沉淀，加粗鞭毛的直径使其达到光学显微镜辨晰限度以内。

步骤:

要染色的细菌应预先在新配制的斜面上传5—6代。最后一代用的斜面部应放约0。5毫升的无菌水再进行接种.将最后一代长好的菌用细长吸管从底部取出放入1ml无菌水中制成菌悬液.放37℃温箱活化半小时再取制片。

2、涂片 取一无划痕且十分清净无油脂的载片,可先将载片置于洗液中浸渍数日，用镊子取后随即以清水冲洗干净（冲洗时勿用手指取捏玻片）,再斜插于木架上，置37℃恒温箱内任其干燥后备用。取上述菌悬液一滴，轻置玻片一端,玻片作倾斜放置,使菌液沿玻片顺向下流，自成一薄菌膜.

3、干燥 让其自然风干。

4、染色 先用染液A染2-4min,水冲洗，再用B液染30—60A，立即用水冲。

5、镜检。

结果：菌体的鞭毛呈黑色。