双菌株混合发酵纳豆的条件优化

思袁杨

沈阳农业大学学报袁圆园16袁47穴1雪院35-40

http院//www.syauxb.com

DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2016.01.007

璐袁等.双菌株混合发酵纳豆的条件优化[J].沈阳农业大学学报袁2016袁47渊1冤院35-40.

双菌株混合发酵纳豆的条件优化

孙军德袁陈思袁杨

摘

璐袁闫潇袁陈璋

渊沈阳农业大学土地与环境学院,沈阳110161冤

要院为降低纳豆氨腥味袁提高纳豆激酶活力袁从工艺条件入手袁以纳豆感官尧挥发性盐基氮含量和纳豆激酶活力作为评判标准袁

首先采用单因素试验探索了沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌的比例尧发酵温度尧发酵时间3个单因素的最佳条件袁然后通过正交试验探索了这3个因素的最佳联合条件遥结果表明:最佳联合条件为沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌比例1颐50袁发酵温度35益袁发酵时间22h袁在此发酵条件下袁纳豆口感好袁氨腥味明显降低袁纳豆激酶活力增大显著袁可达8432.003U窑g-1袁与纳豆芽孢杆菌单独发酵纳豆时相比提高53.74%袁氨含量降低79.81%遥纳豆芽孢杆菌与沼泽红假单胞菌混合发酵在保持纳豆原有的保健功效外袁还丰富了发酵产生的蛋白酶系袁提高了纳豆的营养价值袁并解决了纳豆氨腥味浓郁的问题遥关键词院双菌混合发酵曰沼泽红假单胞菌曰纳豆芽孢杆菌曰纳豆激酶曰挥发性盐基氮曰正交试验中图分类号院TS201.3

文献标识码院A

文章编号院1000-1700渊2016冤01-0035-06

OptimizationofNattoProcessingbyTwoStrainsFermentation

(CollageofLandandEnvironment,ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang110161,China冤

SUNJun-de,CHENSi,YANGLu,YANXiao,CHENZhang

Abstract院Tolowerthebeanyodorandimprovethenattokinaseactivityofnatto,optimizedtheermentationconditions,withthe

contentvolatilebasenitrogenandnattokinaseactivityasindicators.First,thesinglefactorexperimentwasconductedtoexploretheincubationtime.Theorthogonalexperimentwasconductedtoexplorethebestjointcondition.TheoptimumfermentationconditionswereoptimizedasstrainratioofRhodopseudomonaspalustrisandBacillussublitisnatto1颐50,culturetemperature35益,incubationtime22h.Undersuchcondition,nattohadgoodtaste,verylowbeanyodorandhighnattokinaseactivity.Thenattokinaseactivity79.81%.ThemixfermentationofRhodopseudomonaspalustrisandBacillussublitisnattohadagoodhealthfunctionofnatto.Theproteaseproducedenrichedbythefermentationsystemwasalsoandincreasedthenutritionalvalueofnatto.Moreimportantlythismethodsolvedtheproblemofstrongbeanyodor,suitableforChinesetastes,andprovidedanewwayfordevelopingnewtypeofnatto.experiment

Keywords院twostrainsfermentation;Rhodopseudomonaspalustris;Bacillusnatto;nattokinase;volatilebasenitrogen;orthogonalwas8432.003U窑g-1,53.74%higherthanthatofBacillussublitisnattofermentationalone,andtheammoniacontentdecreasedby

bestconditionsofthreefactors,strainratioofRhodopseudomonaspalustrisandBacillussublitisnatto,culturetemperatureand

播袁后来慢慢在民间兴起[1-3]遥纳豆保留了黄豆的营养价值袁与黄豆相比提高了蛋白质的消化吸收率袁发酵过物质袁具有溶解体内纤维蛋白及其他调节生理机能的保健作用[4-5]遥但纳豆在我国推广仍受到一些限制袁成品程产生了纳豆激酶尧超氧化物歧化酶尧异黄酮尧血管紧张肽转化酶抑制剂尧维生素K2尧生育酚等多种生理活性发酵条件和纳豆挥发性气味成分分析方面袁有报道称这种氨腥味多是一些氨氮类化合物[9]及含硫化物[10]袁本纳豆有浓重的氨腥味袁部分消费者不能接受[6-8]遥现国内外对于降低纳豆氨腥味的研究多集中在优化纳豆菌试验利用双菌株混合发酵纳豆袁选择能够降解氨氮类和含硫类化合物[11-12]的沼泽红假单胞菌[13-14]与纳豆芽模生产提供理论依据遥

收稿日期院2015-10-27

基金项目院国家科技支撑计划项目(2013BAD10B00)

作者简介院孙军德(1963-),男,博士,教授,博士生导师,从事农业微生物研究,E-mail:sunjunde108@163.com

纳豆起源于我国袁唐代鉴真和尚东渡日本传经袁带去了我国的豆豉及发酵技术袁开始在日本的寺院里传

孢杆菌混合发酵袁在保留纳豆原有重要生理活性基础上袁降低甚至消除纳豆的氨腥味袁为去氨腥味纳豆大规

1-

36-

材料与方法沈阳农业大学学报第47卷

1.1材料

1.1.1菌种纳豆芽孢杆菌渊Bacillusnatto冤和沼泽红假单胞菌渊Rhodopseudomonaspalustris冤,二者均来自沈阳农业大学微生物教研室保藏菌种遥

1.1.2试剂蛋白胨袁牛肉膏袁干酪素袁福林酚试剂袁酪氨酸为生化试剂遥亚甲基蓝袁甲基红为指示剂遥乙酸钠袁氧化镁袁硼酸袁三氯乙酸袁盐酸袁氯化钠袁磷酸氢二钠袁磷酸二氢钠袁无水碳酸钠为分析纯试剂遥

L-1袁氯化钠5g窑L-1袁pH值为7.2~1.1.3培养基纳豆芽孢杆菌液体培养基院蛋白胨10g窑L-1袁牛肉膏3g窑7.4袁121益灭菌30min遥

1.2方法

1.2.1纳豆的制备市售淀粉豆袁挑取无虫咬表面完整的淀粉豆袁用清水充分洗净袁加入3倍体积的蒸馏水浸泡过夜袁待纳豆吸饱水分后袁倒掉水分袁分装于发酵杯中袁每份30g袁高压蒸汽灭菌锅121益灭菌15min袁无菌条件下自然冷却到50~60益遥根据纳豆芽孢杆菌生长曲线袁当菌悬液浓度OD600值达到0.5袁即菌悬液纳豆芽孢杆菌数量达到590万个时袁纳豆芽孢杆菌生长达到对数期袁此时为最佳接种时期遥将活化好的菌悬液按照淀粉豆体积的12%接种量喷洒在表面袁搅拌均匀袁封好透气膜袁置于37益恒温发酵24h后袁置于4益冰箱后熟24h袁此时纳豆制作完毕遥

1.2.2双菌株混合发酵纳豆的单因素试验用单因素试验分别探索了菌种配比尧发酵温度和发酵时间对发酵纳豆感官尧挥发性盐基氮含量和纳豆激酶活力的影响遥菌种配比渊沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌的配比冤设定分别为50颐1,10颐1,1颐1,1颐10,1颐50[15]曰发酵温度设定为31,34,37,40,43益曰发酵时间设定为18,21,24,27,30h遥每个试验3次重复袁结果取平均值遥

表1正交试验因素水平结果

1.2.3双菌株混合发酵纳豆的工艺优化根据不同Table1Theleveloffactorsoforthogonalexperiment的因素水平设计L9(33)正交试验袁确定最佳发酵条件袁因素Factor

水平

C发酵时间/hB发酵温度/益A菌种配比渊G颐T冤因素与水平见表1遥

Level

ProportionofinoculumFermentationtemperatureFermentationtime1.2.4感官评价纳豆的感官评价采用5个指标院颜

35221:401色尧香气尧滋味尧拉丝尧粘液袁共分为5个等级遥由10人

243721:50

组成感官评定小组袁采取盲评模式袁去掉一个最高分326391:60和一个最低分袁试验设计者不参与评分袁取8个得分注院野G冶为沼泽红假单胞菌袁野T冶为纳豆芽孢杆菌遥的平均值遥感官评定表见表2遥Note:\"G\"isRhodopseudomonaspalustris,and\"T\"isBacillusnatto.

Table2

分数Score8~10颜色

表2双菌株混合发酵纳豆的感官评定结果

Thesensoryevaluationcriterionofcompoundbacteriumnatto

鉴定指标Determinativeindex

香气

滋味

拉丝

粘液

FreshcolorandskinlusterDarkcolorandskinlusterDarkcolorandlusterless豆粒呈茶褐色DarkbrownCrineous

颜色黯哑袁没有光泽颜色黯哑袁表皮有光泽

颜色鲜亮袁表皮有光泽

ColorNoammoniasmellandfaintfragrance少许氨腥味Littleammoniasmell有氨腥味Ammoniasmell氨腥味较重

Heavierammoniasmell强烈氨腥味Strongammoniasmell

无氨腥味袁有淡淡的香味

Fragrance软糯袁湿润袁无后苦味taste

TasteDrawbench/cm40~6030~4020~3010~200~10

Softwaxy袁wetandnobitter较软糯袁湿润袁无后苦味nobittertaste

Heaviersoftwaxy袁wetandHeaviersoftwaxy袁wetandlittlebittertastebittertaste

Heaviersoftwaxy,dryandNosoftwaxy,dryandstrongbittertaste不软糯袁干涩袁后味很苦较软糯袁较干涩袁后味较苦较软糯袁湿润袁后味微苦

很多袁无异物袁粘性强andstrongviscositystrongviscosity

MucusMuchmore,nonforeignmatterMore,nonforeignmatterandNotmuch,nonforeignmatter粘液一般袁无异物袁粘性较强较多袁无异物袁粘性强

6~8

4~6

andheavierviscosity

1~3

Littlemucus,littleforeignmatterandnotmuchviscositynomucusForeignmatter,noviscosityand有异物袁无粘性袁几乎无粘液

粘液较少袁少许异物袁粘性一般

0

豆粒呈暗褐色

第1期

1.2.5挥发性盐基氮含量测定

孙军德等院双菌株混合发酵纳豆的条件优化

-挥发性盐基氮是指食品由于酶和细菌的作用袁在腐败过程中袁蛋白质分解而产

37-生氨以及胺类等碱性含氮物质袁其数值越小袁则食品中所含挥发性的氨含量越小袁可用来衡量纳豆制作过程中产生的具有挥发性的氨的含量袁进而衡量纳豆氨腥味的大小遥挥发性盐基氮含量测定采用半微量定氮法[16]袁参照GBT5009.44-2003遥

1.2.6纳豆激酶活力测定纳豆激酶活力测定采用福林酚法[17]遥

酪氨酸标准曲线制作院取7支大试管袁按表3所列顺序加入各种试剂袁迅速混匀袁置40益恒温水浴显色20min袁取出冷却至室温袁选用680nm波长袁以1号试管为空白对照袁测定每只试管OD680值遥以酪氨酸浓度为横坐标袁OD680为纵坐标袁制作酪氨酸标准曲线渊图1冤袁表中酪氨酸标准溶液浓度为100滋g窑mL-1遥

表3酪氨酸标准曲线制作加样结果

Table3Thereagentsformakingtyrosine

standardcurve

试剂

酪氨酸浓度/滋g窑mL-1

Reagent试管编号No.

0001.05

1100.10.95

2203304405500.50.55

6600.60.45

Concentrationoftyrosine酪氨酸标准液体积/mL蒸馏水/mL

StandardliquidoftyrosineDistilledwater

0.20.30.40.80.70.65

5

5

0.4mol窑L-1Na2CO3/mL福林酚试剂/mLFolin-Ciocalteu1.01.01.01.01.01.01.0

图1酪氨酸标准曲线

Figure1Standardcurveoftyrosine

样品酶活的测定院1%酪蛋白溶液40益水浴5min曰取3支大试管袁1号试管为空白袁分别吸取1mL待测酶液放入3支试管中袁置于40益水浴5min曰向1号试管加入0.4mol窑L-1三氯乙酸2mL摇匀袁向2尧3号试管加入酪蛋白溶液1mL袁3支试管同时放入40益水浴10min曰立即向2尧3号试管加入三氯乙酸2mL摇匀袁向1号试管补充酪蛋白溶液1mL摇匀袁将3支试管室温沉淀10min曰5000r窑min-1离心10min袁分别取上清1mL加入另外3支试管中袁再加入0.4mol窑L-1无水碳酸钠5mL和福林酚试剂1mL袁40益水浴显色20min曰测量OD680值遥

蛋白酶活力单位定义院在40益袁pH值7.4的条件下袁1min水解酪蛋白产生1滋g酪氨酸的酶量为一个酶活单位袁以U窑g-1表示遥蛋白酶的酶活力按下面公式计算院

蛋白酶活力渊U窑g-1冤=[(A-A0)/(t伊W)]伊K伊V伊N

式中院A为样品吸光度曰A0为空白吸光度曰K为吸光常数渊111.38冤曰V为反应液的总体积渊6mL冤曰t为反应时间

2

渊10min冤曰N为稀释倍数曰W为酶液的体积渊1mL冤遥

结果与分析

2.1菌种配比对纳豆品质的影响

按照12%的接种量袁以沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌50颐1尧10颐1尧1颐1尧1颐10尧1颐50的比例发酵黄豆袁对发酵完成的纳豆进行感官评价尧挥发性盐基氮含量测定和纳豆激酶活力的测定遥纳豆感官得分和纳豆激酶活力越高袁表明挥发性盐基氮含量越低袁则纳豆品质越好遥由图2尧图3尧图4可知袁菌种配比为1颐50时袁纳豆感官得分最高袁挥发性盐基氮含量相对较低袁纳豆激酶活力也相对较高袁综合以上结果袁菌种配比为1颐50遥2.2发酵温度对纳豆品质的影响

按照12%的接种量袁以沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌为1颐50的比例袁温度梯度设置为31袁34袁37袁40袁43益发酵黄豆袁对发酵完成的纳豆进行感官评价尧挥发性盐基氮含量测定和纳豆激酶活力测定遥由图5尧图6尧图7可知袁发酵温度对纳豆品质的影响显著袁在37益时感官得分和纳豆激酶活力达到最大值袁此时挥发性盐基氮含量也相对较低袁所以发酵温度为37益遥

-

38-

沈阳农业大学学报第47卷

图2菌种配比对感官评价的影响图3菌种配比对挥发性盐基氮含量的影响图4菌种配比对纳豆激酶活力的影响

Figure3InfluenceofstrainratioontheFigure4InfluenceofstrainratioonFigure2Influenceofstrain

thenattokinaseactivityratioonsensoryevaluationcontentofvolatilebasenitrogen

图5

发酵温度对感官评价的影响图6发酵温度对挥发性盐基氮含量的影响图7发酵温度对纳豆激酶活力的影响

Figure5InfluenceofFigure6InfluenceoffermentationFigure7Influenceoffermentationfermentationtemperatureontemperatureonthenattokinasetemperatureonthecontentofvolatile

sensoryevaluationbasenitrogenactivity

发酵时间对纳豆品质的影响

按照12%的接种量袁以沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌为1颐50的比例袁37益的发酵温度袁发酵时间设置梯度为18袁21袁24袁27袁30h发酵黄豆袁对发酵完成的纳豆进行感官评价尧挥发性盐基氮含量测定和纳豆激酶活力测定遥

由图8尧图9尧图10可知袁24h时感官得分和纳豆激酶活力都较高袁挥发性盐基氮含量相对较低袁所以发酵时间为24h遥

2.3

图8发酵时间对感官评价的影响图9发酵时间对挥发性盐基氮含量的影响图10发酵时间对纳豆激酶活力的影响Figure8InfluenceoffermentationFigure9InfluenceoffermentationtimeFigure10Influenceoffermentation

timeonsensoryevaluationonthecontentofvolatilebasenitrogentimeonthenattokinaseactivity

2.4双菌株混合发酵纳豆的条件优化

在单因素试验基础上进行双菌株混合发酵正交试验袁根据菌种配比尧发酵温度尧发酵时间对纳豆感官尧挥发性盐基氮含量和纳豆激酶活力的影响确定正交试验最佳发酵条件遥

由表4可知袁感官得分的显著影响顺序为B>C>A袁比较各因素K值大小袁可得出3个因素最佳组合为A2B2C3袁即菌种配比渊沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌的配比冤为1颐50袁发酵温度为37益袁发酵时间为26h曰对挥发性盐基氮含量的显著影响顺序为C>B>A袁比较各因素的K值大小袁可得出3个因素最佳组合为A2B3C1袁即菌种配比为1颐50袁发酵温度为39益袁发酵时间为22h曰对纳豆激酶活力的显著影响顺序为B>C>A袁比较各因素K值大小袁可得出3个因素最佳组合为A3B1C1袁即菌种配比为1颐60袁发酵温度为35益袁发酵时间为22h遥

对于因素A袁其对感官尧挥发性盐基氮含量和纳豆激酶活力的影响都排在第3位袁以感官和挥发性盐基氮

第1期孙军德等院双菌株混合发酵纳豆的条件优化

含量为评价指标时都取A2袁以纳豆激酶活力为评价指标时取A3袁故应在A2和A3中选择袁由于取A2时袁感官得分比A3时提高1.79%袁挥发性盐基氮含量降低13.5%袁纳豆激酶活力仅降低7.27%袁综合3项指标袁A2与A3相比感官得分有所提高袁氨含量也下降明显袁纳豆激酶活力仅稍微下降袁所以A因素应取A2曰对于B因素袁其对感官得分的影响排在第1位袁此时取B2袁其对纳豆激酶活力的影响也排在第1位袁此时取B1袁而其对挥发性盐基氮含量的影响排在第2位袁为次要因素袁故B因素在B1和B2中选择遥取B1时袁感官得分仅降低了12.69%袁挥发性盐基氮含量略有下降袁相差不大袁但纳豆激酶活力升高24.27%袁增高明显袁故B因素应取B1曰对于C因素袁其对挥发性盐基氮含量的影响排在第1位袁此时取C1袁对感官和纳豆激酶活力影响都排在第2位袁为次要因素袁因此C因素取C1遥故3个因素最佳发酵条件为A2B1C1袁即菌种比例为1颐50袁发酵温度为35益袁发酵时间为22h遥

表4正交试验结果分析表

Table4Resultoforthogonaldesign

因素Factor

试验号TestNo.12345678

感官评价Sensoryevaluation

9

K1K2K3R

A菌种配比渊G颐T冤Proportionofinoculum1渊1:40冤112233

B发酵温度/益Fermentationtemperature1渊35冤2渊37冤1231233.59237.85635.35570.26071.19559.0435471.4973900.6173610.6081860.88912.1524.2643

C发酵时间/hFermentation1渊22冤2渊24冤3渊26冤2313134.76734.25937.77855.25369.90775.3395208.9864263.1283610.6081598.37820.0863.5192time感官评价evaluation32.00036.66737.33332.77840.00035.40036.00036.90033.333Sensory

挥发性盐基氮含量/mg窑100gbasenitrogen56.78474.92868.65670.28073.64043.96083.72065.01664.512

-1

-39-纳豆激酶活力/U窑g-1Nattokinaseactivity5350.6603610.6082740.5825205.6563610.6084118.1234480.6345858.1763973.119

Contentofvolatile

2渊1:50冤

3渊39冤

3渊1:60冤

35.33336.05935.41166.78962.62771.0833900.6174311.4624770.643870.0268.4560.726

挥发性盐基氮含量K1Contentofvolatilebasenitrogen

K2K3RK1K2K3R

纳豆激酶活力Nattokinaseactivity

在最佳的发酵条件下进行验证试验袁3次试验取其平均值袁感官得分为37.33分袁挥发性盐基氮含量为

32.144mg窑100g-1袁纳豆激酶活力为8432.003U窑g-1袁相比于纳豆芽孢杆菌纯菌单独发酵袁感官得分为39.17分袁挥发性盐基氮含量为159.208mg窑100g-1袁纳豆激酶活力为3900.617U窑g-1袁纳豆激酶活力增高53.74%袁氨含量降低了79.81%遥沼泽红假单胞菌和纳豆芽孢杆菌混合发酵不仅氨腥味明显降低袁还有淡淡的豆香和沼泽红假单胞菌的清香味袁并且纳豆激酶活力也有显著提高袁口感上粘液多袁软糯袁拉丝明显袁易被国内消费者接受遥

3讨论

本试验通过对影响发酵过程中的3个单因素进行了探讨以及正交试验确定了最佳发酵工艺条件院沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌的配比为1颐50袁发酵温度为35益袁发酵时间为22h袁在此条件下发酵得到的纳豆感官得分为37.33分袁纳豆激酶活力为8432.003U窑g-1袁氨含量为32.114mg窑100g-1遥产品纳豆氨腥味明显降低袁感官及纳豆激酶活力都有明显提高遥纳豆作为一种发酵食品袁有非常高的食药用价值遥但现在市场上销售的纳豆多数

-

40-

沈阳农业大学学报第47卷

氨腥味浓郁袁部分国内消费者仍不能接受遥改善纳豆氨腥味浓郁可以从复合菌发酵角度出发袁选择具有能够降低氨腥味物质的菌株与纳豆芽孢杆菌混合发酵袁从而有针对性的改善纳豆感官遥目前袁有关纳豆多菌发酵的报道还较少[22-28]袁本研究探索了采用能够降低水体氨氮和硫化物含量的沼泽红假单胞菌与纳豆芽孢杆菌的双菌混合发酵的工艺袁因沼泽红假单胞菌本身蛋白质含量丰富袁并含有辅酶Q尧相当完全的B族维生素尧VK等生理活性物质袁菌体含有的类胡萝卜素还具有显著的抗氧化作用遥通过沼泽红假单胞菌和纳豆芽孢杆菌的混合发酵不但提高了纳豆激酶活力袁而且解决了纳豆的氨腥味问题袁改善了纳豆的口味袁丰富了纳豆的营养价值袁使之成为一种易被国内消费者接受的绿色食品遥参考文献院

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[责任编辑李薇]