显微镜油浸系物镜的使用

实验、显微镜油浸系物镜的使用 一、目的和要求

1、了解油浸系物镜的基本原理。 2、学习和掌握油浸系物镜的使用方法。 3、用油镜观察各种细菌的形态。 二、实验原理

普通光学显微镜的基本结构可分为光学系统和机械装置两大部分。光学系统主要包括：物镜（5～100倍）、目镜（5～20倍）、聚光镜和光源系统4个主要部件；其次还包括滤光片、载玻片和盖玻片。机械装置包括：镜座与镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台与移动器、粗调焦机构、微调焦机构。

微生物学研究用的显微镜通常有低倍物镜（16mm，10）、高倍物镜（4mm，40-45）和油镜（1.8mm，95-100）3种。

油镜与其他物镜的不同是载玻片与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。镜头油常选用香柏油，因香柏油的折射率n＝1.52，与玻璃基本相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果载玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系；当光线通过载玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样视野的照明度就减低了。

利用油镜不但能增加照明度；更主要的是能增加数值口径。因为显微镜的放大效能由其数值孔径决定的。

所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NA= n sinθ；

数值孔径的大小又是衡量一台显微镜分辨力强弱的依据；分辨力是指显微镜能辨别物体两点间最小距离的能力；

分辨力= λ / 2n sinθ；

式中：λ：光源波长，可见光波长为0.4 ~ 0.7μm；n：介质折射率，香柏油、水和空气的n值分别为1.52、1.33和1.0；θ：1/2最大入射角，最大入射角取决于物镜直径和工作距离，最大为120°。

三、实验器材

1、菌种：乳酸链球菌、八叠球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等多种细菌的涂片。

2、试剂：香柏油、二甲苯。

3、仪器及用具：普通光学显微镜、擦镜纸等。

四、操作步骤

1、将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约4cm，坐正。

2、将低倍物镜（10）旋到镜筒下方；聚光器调至最高位置，把光圈完全打开；调节光源直至视野内得到最均匀最适宜的照明为止。

3、低倍镜观察

低倍物镜（10）视野面广，焦点深度较深，为易于发现目标确定检查位置，故应先用低倍镜观察为宜。

先将标本玻片置于载物台上（标本朝上），并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调螺旋，眼睛看目镜，同时慢慢旋转粗调节螺旋，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋，上下微微转动，仔细调节焦距和照明，直至视野内获得清晰的物象，及时确定需进一步观察的部位。

移动推动器。将所要观察的部位置于视野中心，准备换高倍镜观察。

4、高倍镜观察

将高倍物镜（40）转至镜筒下方（在转换物镜时，要从侧面注视。以防低倍镜未对好焦距而造成镜头与玻片相撞），调节光线亮度适中，再仔细反复转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，再移动推动器选择最满意的镜检部位将染色标本移至视野，待油镜观察。

5、油镜观察

用粗调螺旋下降载物台，转动转换器将油镜转至镜筒正下方。在标本镜检部位滴上一滴香柏油。慢慢转动粗调螺旋，上升载物台，并从侧面注视，使油浸物镜浸入油中，直到

几乎与标本接触时为止（注意切勿压到标本，以免压碎玻片，甚至损坏油镜头）。

眼睛看目镜，微微转动粗调螺旋，下降载物台（注意：此时只准下降载物台，不能向上调动），当视野中有模糊的标本物象时，改用细调螺旋，并移动标本直至标本物象清晰为止。

如果下降载物台已使镜头离开油滴又尚未发现标本时，可重新按上述步骤操作直到看清物象为止。仔细观察并绘图。

换标本观察时先下降载物台，更换标本，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图，重复观察时可不加或少加香柏油。

6、观察完毕后的工作

观察完毕，下降载物台，移开物镜镜头，取下标本片，清洁油镜。

★ 油镜清洁方法：先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。

可用绸布擦净显微镜的金属部件。将各部分还原，将接物镜转成八字形，再向下旋，不能正对聚光器，同时下降聚光器。罩上镜套，然后放回镜箱中。

五、实验报告

1、实验目的和原理

2、基本操作过程

3、实验结果：

绘图说明你观察到的细菌的形态，注意标明物镜放大倍数和细菌名称。

4、思考题：

使用油镜时，应注意哪些问题？为什么必须使用镜头油？

实验三、细菌染色技术——简单染色

一、目的和要求

1、学习微生物涂片和染色的基本技术。 2、学习和掌握细菌的简单染色法。 3、巩固显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理

细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料3大类。碱性染料的离子

带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌常带负电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。常用的碱性染料有美蓝、有结晶紫、碱性复红、番红等。

染色前必须先固定细菌，其目的一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。

简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态。

三、实验器材

1、菌种：大肠杆菌和枯草芽孢杆菌培养物

2、试剂：结晶紫染液、番红染液、香柏油、二甲苯等。

3、仪器及用具：普通光学显微镜、擦镜纸、酒精灯、接种环、载玻片等。

四、操作步骤

1、涂片：在洁净无油腻的载玻片放一小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。

2、干燥：将涂片于空气中自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。

3、固定：手执载玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。待载玻片冷却后，再加染料。

4、染色：载玻片置于平台上，加适量（以盖满菌膜为度）结晶紫染色液（或石炭酸复红液）于菌膜部位，染l-2min。

5、水洗：倾去染色液，用自来水细流自玻片一端轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。

6、干燥：自然干燥或用吸水纸盖在涂片部位以吸去水分（注意勿擦去菌体）。

7、镜检：用油镜观察并绘图。

五、实验报告内容

1、实验目的和原理

2、基本操作过程

3、实验结果：绘图表示你观察到的细菌形态，，注意：表现出个体形态和排列特征，画出视野，标注放大倍数，说明此细菌的菌落形态和采样地点。

4、思考题：

在制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？使用油镜时，应注意哪些问题？为什么必须使用镜头油？