用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108277269 A(43)申请公布日 2018.07.13

(21)申请号 201711015244.7(22)申请日 2017.10.25

(71)申请人 长沙三济生物科技有限公司

地址 410205 湖南沙市高新开发区麓

谷国际工业园桐梓坡西路229号A5栋3楼(72)发明人 滕祥云　尹贞　毛平道　黄少亚　(51)Int.Cl.

C12Q 1/6883(2018.01)C12N 15/11(2006.01)

权利要求书2页 说明书13页序列表3页 附图11页

CN 108277269 A()发明名称

用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒(57)摘要

本发明涉及一种用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括分别针对VKORC1-1639、CYP2C9*2、CYP2C9*3等位基因及GAPDH内参基因的扩增引物；所述试剂盒包括包含所述扩增引物的PCR反应液。本发明提供的所述试剂盒灵敏度高，可达万分之一，最低检测限仅为1-2拷贝，特别适合于低含量突变样本的检测；与测序法相比，本发明的检测结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了PCR产物污染的风险；此外，还具有检测速度快，适用于高通量样本检测的优点。

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1.一种用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对，其特征在于，所述华法林用药相关基因检测的多态性位点分别为VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3，所述引物对包括：

针对VKORC1-1639等位基因的扩增引物，如下：

扩增VKORC1-1639野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：1所示，5’-CTCAAGTGATCCACCCACCT-3’，探针，如SEQ ID NO：2所示5’FAM-TGCGGTGGCTCACGCCTATAATCCTAGC-TAMRA 3’；扩增VKORC1-1639野生型上游引物，如SEQ ID NO：3所示：5’-CGTCATATACCATCATTTGACG-3’；

扩增VKORC1-1639突变型上游引物，如SEQ ID NO：4所示：5’-CGTCATATACCATCATTTGACA-3’；

针对CYP2C9*2等位基因的扩增引物，如下：

扩增CYP2C9*2野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：5所示，5’-CTATGCATCTGTCTACAACAGTTAC-3’，探针，如SEQ ID NO：6所示，5’FAM-AGGAAGCCCGCTGCCTTGTGG-TAMRA 3’；扩增CYP2C9*2野生型上游引物，如SEQ ID NO：7所示，5’-TACATGCTCATGTGTATCC-3’；扩增CYP2C9*2突变型上游引物，如SEQ ID NO：8所示，5’-TACATGCTCATGTGTATCT-3’；针对CYP2C9*3等位基因的扩增引物，如下：

扩增CYP2C9*3野生型和突变型通用下游引物和探针：下游引物，如SEQ ID NO：9所示，5’-CGTGTGATTGGCAGAAACC-3’，探针，如SEQ ID NO：10所示，5’FAM-AGTTCGCAGTCCTGCGTCACTCGC-TAMRA 3’；扩增CYP2C9*3野生型上游引物，如SEQ ID NO：11所示，5’-AGTGCGCAGTGACGTCTAT-3’；扩增CYP2C9*3突变型上游引物，如SEQ ID NO：12所示，5’-AGTGCGCAGTGACGTCTAG-3’；针对GAPDH内参基因的扩增引物，如下：扩增GAPDH基因的上游引物，如SEQ ID NO：13所示，5’-ATCCTGGGCTACACTGAGCAC-3’；扩增GAPDH基因的下游引物，如SEQ ID NO：14所示，5’-CTCAGTGTAGCCCAGGATGCCCTT-3’；

扩增GAPDH基因的探针，如SEQ ID NO：15所示，5’JOE-AGGTGGTCTCCTCTGACTTCAA-TAMRA 3’。

2.一种用于检测华法林用药相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述华法林用药相关基因检测的多态性位点分别为VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3，所述试剂盒包括：

PCR反应液1，所述PCR反应液1含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；

PCR反应液2，所述PCR反应液2含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；

PCR反应液3，所述PCR反应液3含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；

PCR反应液4，所述PCR反应液4含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；

PCR反应液5，所述PCR反应液5含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ 

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ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；

PCR反应液6，所述PCR反应液6含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：阳性对照品1，其为插有SEQIDNO：1和SEQ ID NO：3扩增产物、插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4扩增产物、插有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14扩增产物的三种质粒所组成的质粒混合物；

阳性对照品2，其为插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7扩增产物、插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12扩增产物、插有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14扩增产物的五种质粒所组成的质粒混合物；

其中，质粒载体为pMD18-T质粒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照1质粒混合物中VKORC1-1639突变纯合子质粒、VKORC1-1639野生纯合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1：2；所述阳性对照2质粒混合物中CYP2C9*2突变纯合子质粒、CYP2C9*2野生纯合子质粒、CYP2C9*3突变纯合子质粒、CYP2C9*3野生纯合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1：1：1：2。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括空白对照品，所述空白对照品为灭菌纯化水。

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用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒

技术领域

[0001]本发明涉及体外核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于检测华法 林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒。

背景技术

[0002]华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服 抗凝药物之一，用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、心脏瓣膜置换 术及房颤导致的血栓形成。华法林治疗窗较窄，很小的剂量都可能导 致不良反应的发生，且在不同个体达到相同作用效果，高低剂量者之 间可相差10倍以上。

[0003]维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)是维生素K循环 中的关键酶，华法林因抑制该酶而阻断维生素K以辅因子形式参与 羧化酶的催化反应，抑制了凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的功能活性，从 而产生抗凝作用。国内外大量研究发现：VKORC1基因突变会增加 该酶对华法林的敏感性，从而增强抗凝效果，其中比较常见的突变有 启动子区的G-1639A突变及1号内含子的C1173T突变。目前研究已 经证实1639G>A和1173C>T两个位点是完全连锁的。VKORC1 -1639AA(1173TT)基因型患者需要的华法林剂量显著低于1639GA 或GG(1173TC或CC)。美国食品药品监督管理局(FDA)明确指 出：在使用华法林时，建议检测VKORC1基因型。

[0004]华法林是由S-华法林和R-华法林组成的消旋体，在体内S-华法林 反映了60％～70％的抗凝活性，而R-华法林占30％～40％，其中S- 华法林主要由CYP2C9代谢，故CYP2C9基因多态性对华法林剂量 影响较大。CYP2C9具有高度遗传多态性，较常见的基因突变体是 CYP2C9*2(rs1799853)和CYP2C9*3(rs1057910)，其编码的酶活性分 别比野生型CYP2C9*1降低了30％和80％，导致CYP2C9基因突变 个体对华法林的需求剂量较低。携带这两个等位基因的个体服用华法 林后达到稳态浓度需要的时间较长，且在使用初期有较高出血危险性， 因此，CYP2C9*2或CYP2C9*3基因型个体服用华发林时应减少剂量， 但是等位基因突变个体长期治疗过程中过度抗凝的危险性没有增加。 其他突变体CYP2C9*4，CYP2C9*5，CYP2C9*6以及CYP2C9*1l等 在人群中突变频率很低，其对华法林需求剂量的影响还有待于进一步 研究。CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率在不同种族中有较大差 异。高加索人中，CYP2C9*2和CYP2C9*3等位基因频率大约分别是 8％～20％和6％～10％。而CYP2C9*2在亚洲人群中不存在，在美洲 黑人中大约是2％～4％。CYP2C9*3在亚洲人中的频率是l％～4％， 在美洲黑人中是l％～2％。临床研究结果显示，达到相同抗凝效果时， CYP2C9*2、*3基因型患者的使用剂量较野生型患者低。美国食品药 品监督管理局(FDA)明确指出：在使用华法林时，建议检测CYP2C9 基因型。

[0005]目前医院用于VKORC1和CYP2C9基因检测的“金标准”是PCR 直接测序法，但直接测序法的操作程序较复杂，敏感性不高，仅能检 测出20～30％以上的突变株等。相比于直接测序法，ARMS-TaqMan 法的灵敏性更高、成本更低。[0006]ARMS也称作等位基因特异性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)， 其原理是PCR

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引物的3’端末位碱基与其模板DNA存在错配时，一 般将导致扩增效率急剧下降，设计等位基因特异性PCR扩增引物， 在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR 扩增信号，从而检测出突变。

[0007]实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司 推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常 规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化 程度高等特点，目前已得到广泛应用。[0008]荧光定量PCR技术一般分为探针法和染料法，本试剂盒采用的是 TaqMan荧光探针法：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特 异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光 基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被 淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'～3'外切酶活性将探针酶切降 解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收 到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现 了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。[0009]目前，在现有已公开报道的文献中，只有本研究团队于2015年时 所申请的中国专利CN201510672828.6和2016年时所申请的中国专利 CN201610771920.2分别单独对医院用于VKORC1和CYP2C9基因分 型检测的“金标准”(PCR-直接测序法)进行了创新改进；但是该两项 专利CN201510672828.6和CN201610771920.2所涉及的技术方案， 在该两项产品分别投入临床市场后，尤其是在医院大面积应用过程中， 发现所设计的引物及试剂盒特异性还不是特别高，检测结果的准确性 也会偶尔出现波动，推测可能是引物设计与医院实际分子诊断实验室 的环境存在适应性问题，此外，该两项试剂盒单独应用时往往不能满 足临床华法林用药相关二基因分型的需求，需要对两个试剂盒结合使 用，在临床实践中存在诸多操作问题及体系交叉问题；因此，将华法 林用药相关二基因试剂盒相结合并将引物重新设计优化及对应PCR 体系稳定性尚有较大的改进空间；我们在多方考察各医院临床分子诊 断实验室环境及统计分析有问题的检测报告结果后，并全面对两个研 发项目的引物进行了重新优化设计，将二基因检测试剂盒合二为一， 优化了新试剂盒的PCR反应体系，并显著改进了新试剂盒产品性能。

发明内容

[0010]为了解决现有技术检测华法林用药相关VKORC1和CYP2C9基 因多态性过程中存在检测结果准确性不高、操作程序复杂及敏感性不 高的技术问题，本发明提供一种检测结果准确、操作程序简单、敏感 性高、特异性强、测序速度快并有效满足临床检验要求的检测华法林 用药相关VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性的引 物对及试剂盒；采用ARMS结合QPCR技术来实现。

[0011]本发明提供一种用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对， 所述华法林用药相关基因检测的多态性位点分别为VKORC1-1639、 CYP2C9*2和CYP2C9*3，所述引物对包括：

[0012]针对VKORC1-1639等位基因的扩增引物，如下：

[0013]扩增VKORC1-1639野生型和突变型通用下游引物和探针：[0014]下游引物，如SEQ ID NO：1所示，5’-CTCAAGTGATCCAC CCACCT-3’，[0015]探针，如SEQ ID NO：2所示5’FAM-TGCGGTGGCTCACGC CTATAATCCTAGC-TAMRA 3’；

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扩增VKORC1-1639野生型上游引物，如SEQ ID NO：3所示： 5’-CGTCATATACCATCATT

TGACG-3’；

[0017]扩增VKORC1-1639突变型上游引物，如SEQ ID NO：4所示： 5’-CGTCATATACCATCATTTGACA-3’；

[0018]针对CYP2C9*2等位基因的扩增引物，如下：

[0019]扩增CYP2C9*2野生型和突变型通用下游引物和探针：[0020]下游引物，如SEQ ID NO：5所示，5’-CTATGCATCTGTCTACA ACAGTTAC-3’，[0021]探针，如SEQ ID NO：6所示，5’FAM-AGGAAGCCCGCTGCC TTGTGG-TAMRA 3’；[0022]扩增CYP2C9*2野生型上游引物，如SEQ ID NO：7所示，5’- TACATGCTCATGTGTATCC-3’；

[0023]扩增CYP2C9*2突变型上游引物，如SEQ ID NO：8所示，5’- TACATGCTCATGTGTATCT-3’；

[0024]针对CYP2C9*3等位基因的扩增引物，如下：

[0025]扩增CYP2C9*3野生型和突变型通用下游引物和探针：[0026]下游引物，如SEQ ID NO：9所示，5’-CGTGTGATTGGCAGAAA CC-3’，[0027]探针，如SEQ ID NO：10所示，5’FAM-AGTTCGCAGTCCTGCG TCACTCGC-TAMRA 3’；[0028]扩增CYP2C9*3野生型上游引物，如SEQ ID NO：11所示，5’ -AGTGCGCAGTGACGTCTAT-3’；

[0029]扩增CYP2C9*3突变型上游引物，如SEQ ID NO：12所示，5’ -AGTGCGCAGTGACGTCTAG-3’；

[0030]针对GAPDH内参基因的扩增引物，如下：[0031]扩增GAPDH基因的上游引物，如SEQ ID NO：13所示，5’- ATCCTGGGCTACACTGAGCAC-3’；

[0032]扩增GAPDH基因的下游引物，如SEQ ID NO：14所示，5’- CTCAGTGTAGCCCAGGATGCCCTT-3’；

[0033]扩增GAPDH基因的探针，如SEQ ID NO：15所示，5’JOE- AGGTGGTCTCCTCTGACTTCAA-TAMRA 3’。

[0034]本发明还提供一种用于检测华法林用药相关基因多态性的试剂 盒，所述华法林用药相关基因检测的多态性位点分别为 VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3，所述试剂盒包括：

[0035]PCR反应液1，所述PCR反应液1含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；[0036]PCR反应液2，所述PCR反应液2含有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；[0037]PCR反应液3，所述PCR反应液3含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；[0038]PCR反应液4，所述PCR反应液4含有如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；[0039]PCR反应液5，所述PCR反应液5含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、

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SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针；[0040]PCR反应液6，所述PCR反应液6含有如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、 SEQ ID NO：15所示的扩增引物及探针。[0041]在本发明提供的用于检测华法林用药相关基因多态性的试剂盒 的一较佳实施例中，所述试剂盒还包括：阳性对照品1，其为插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3扩增产物、插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4扩增产物、插有SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14扩增产物的 三种质粒所组成的质粒混合物；[0042]阳性对照品2，其为插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7扩增 产物、插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12扩增产物、插有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14扩增产 物的五种质粒所组成的质粒混合物；[0043]其中，质粒载体为pMD18-T质粒。

[0044]在本发明提供的用于检测华法林用药相关基因多态性的试剂盒 的一较佳实施例中，所述阳性对照1质粒混合物中VKORC1-1639突 变纯合子质粒、VKORC1-1639野生纯合子质粒和内参GAPDH质粒 的数量比为1：1：2；所述阳性对照2质粒混合物中CYP2C9*2突变 纯合子质粒、CYP2C9*2野生纯合子质粒、CYP2C9*3突变纯合子质 粒、CYP2C9*3野生纯合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1： 1：1：2。

[0045]在本发明提供的用于检测华法林用药相关基因多态性的试剂盒 的一较佳实施例中，所述试剂盒还包括空白对照品，所述空白对照品 为灭菌纯化水。[0046]相较于现有技术，本发明提供的用于检测华法林用药相关基因多 态性的引物对及试剂盒具有以下有益效果：[0047]一、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度 高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性时，具有定性 准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测 序步骤简单、测序速度快、一个小时完成一次上机反应、直接给出检 测位点荧光曲线及结果直观的优点；

[0048]二、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度 高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测 VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性时，可实时监 测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上荧光定量PCR 仪、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测 序法灵敏度更高，更适合用于突变分析；

[0049]三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品和阳性对照品，使得 所述试剂盒在检测VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多 态性时，可以更好的确保检测结果的准确性。附图说明

[0050]图1为临床样品VKORC1-1639野生型的荧光扩增曲线图；[0051]图2为临床样品VKORC1-1639突变杂合型的荧光扩增曲线图；[0052]图3为临床样品VKORC1-1639突变纯合型的荧光扩增曲线图；[0053]图4为临床样品VKORC1-1639阳性对照品的荧光扩增曲线图；

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图5为临床样品VKORC1-1639空白对照品的荧光扩增曲线图；

[0055]图6为临床样品CYP2C9*2野生型的荧光扩增曲线图；[0056]图7为临床样品CYP2C9*2突变杂合型的荧光扩增曲线图；[0057]图8为临床样品CYP2C9*2突变纯合型的荧光扩增曲线图；[0058]图9为临床样品CYP2C9*3野生型的荧光扩增曲线图；

[0059]图10为临床样品CYP2C9*3突变杂合型的荧光扩增曲线图；[0060]图11为临床样品CYP2C9*3突变纯合型的荧光扩增曲线图；[0061]图12为临床样品CYP2C9阳性对照品的荧光扩增曲线图；[0062]图13为临床样品CYP2C9空白对照品的荧光扩增曲线图；

[0063]图14至图15为VKORC1-1639多组设计引物的荧光扩增曲线图； 其中图14的结果均不准确，只有图15的结果真实可靠。

[00]图16至图17为CYP2C9*2多组设计引物的荧光扩增曲线图；其 中图16的结果均不准确，只有图17的结果真实可靠；

[0065]图18至图19为CYP2C9*3多组设计引物的荧光扩增曲线图；其 中图18的结果均不准确，只有图19的结果真实可靠。具体实施方式

[0066]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合 附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所 描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0067]实施例1：试剂盒的制备(30测试/盒)[0068]1、引物和探针的设计与合成

[0069]针对人VKORC1基因突变体1639以及CYP2C9基因突变体*2 和*3，选择特异的突变位点，选用的引物和探针设计在VKORC1突 变位点和附近的保守区，避免在引物结合区域出现有SNP(通过在线 NCBI网站对靶基因序列的SNP进行检索)，通过在线NCBI网站进 行Primer Blast，确认引物对的特异性扩增。探针位于一对引物之间 的区域，且避免其结合区域出现有SNP；其中扩增引物和荧光探针先 经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中目的探针SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:10的5’端采用荧光报告基团(FAM)标记， 内参探针SEQ ID NO:15的5’端采用荧光报告基团(JOE)标记，3’ 端均采用荧光淬灭基团(TAMRA)标记。

[0070]表1.突变位点与类型

[0071]

[0072]

扩增序列如表2：

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表2.特异性扩增引物及引物序列

[0075]

2、对照品选择

[0076]阳性对照品1为插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3扩增产物、 插有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4扩增产物、插有SEQ ID NO:13 和SEQ ID NO:14扩增产物的三种质粒所组成的质粒混合物；所述质 粒混合物中VKORC1-1639突变纯合子质粒、VKORC1-1639野生纯 合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1：2。[0077]阳性对照品2为插有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7扩增产物、 插有SEQ ID NO：5和

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SEQ ID NO：8扩增产物、插有SEQ ID NO： 9和SEQ ID NO：11扩增产物、插有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO： 12扩增产物、插有SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14扩增产物的五 种质粒所组成的质粒混合物；所述质粒混合物中CYP2C9*2突变纯合 子质粒、CYP2C9*2野生纯合子质粒、CYP2C9*3突变纯合子质粒、 CYP2C9*3野生纯合子质粒和内参GAPDH质粒的数量比为1：1：1： 1：2。其中，质粒载体为pMD18-T质粒。[0078]空白对照品为灭菌纯化水。[0079]3、PCR预混液1组成[0080]表3.PCR预混液1组成

[0081]

原料名称 2×Fast TaqMan Mixture 50×Low ROX 总量

[0082]4、PCR预混液2组成[0083]表4.PCR预混液2组成

[0084]

测试单人份用量(μL) 40 2 42 30测试/盒(μL)

1200 60 1260

原料名称 测试单人份用量(μL)

2×Fast TaqMan Mixture 25 50×Low ROX 1 总量 26 [0085]5、CYP2C9*2(野生型WT)混合液的组成[0086]表5.CYP2C9*2(WT)混合液的组成

[0087]

30测试/盒(μL) 750 30 780

[0088]

[00][0090][0091]

6、CYP2C9*2(突变型MT)混合液的组成

表6.CYP2C9*2(MT)混合液的组成

测试单人份用量(μL)

10

原料名称 30测试/盒(μL)

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22.5 22.5 15 7.5 7.5 15 90

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CYP2C9*2-MT-F(10uM) 0.75

CYP2C9*2-R(10uM) 0.75 CYP2C9*2-P(10uM) 0.5 Ref2-F(10uM) 0.25 Ref2-R(10uM) 0.25 Ref2-P(10uM) 0.5 总量 3 [0092]7、CYP2C9*3(野生型WT)混合液的组成[0093]表7.CYP2C9*3(WT)混合液的组成

[0094]

原料名称 测试单人份用量(μL) CYP2C9*3-WT-F(10uM) 0.75 CYP2C9*3-R(10uM) 0.75 CYP2C9*3-P(10uM) 0.5 Ref2-F(10uM) 0.25 Ref2-R(10uM) 0.25 Ref2-P(10uM) 0.5 总量 3 [0095]8、CYP2C9*3(突变型MT)混合液的组成[0096]表8.CYP2C9*3(MT)混合液的组成

[0097]

30测试/盒(μL) 22.5 22.5 15 7.5 7.5 15 90

原料名称 测试单人份用量(μL)

CYP2C9*3-WT-F(10uM) 0.75 CYP2C9*3-R(10uM) 0.75 CYP2C9*3-P(10uM) 0.5 Ref2-F(10uM) 0.25 Ref2-R(10uM) 0.25 Ref2-P(10uM) 0.5 总量 3 [0098]9、VKORC1(野生型WT)混合液的组成[0099]表9.VKORC1(WT)混合液的组成

[0100]

30测试/盒(μL) 22.5 22.5 15 7.5 7.5 15 90

原料名称

VKORC1-Y-F(10uM) VKORC1-R(10uM) VKORC1-P(10uM) Ref2-F(10uM) Ref2-R(10uM) Ref2-P(10uM) 测试单人份用量(μL)

0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

11

30测试/盒(μL)

15 15 15 15 15 15

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90

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总量

[0101][0102][0103]

3

10、VKORC1(突变型MT)混合液的组成表10.VKORC1(MT)混合液的组成

[0104]

[0105][0106][0107]

11、阳性对照品的组成表11.阳性对照品的组成

30测试/盒(μL) 30 60

原料名称 体积(μL)

阳性对照1 1 阳性对照2 2 [0108]12、空白对照品的组成[0109]表12.空白对照品的组成

[0110]

原料名称 体积(μL) 30测试/盒(μL) 空白对照 58 1740 [0111]实施例2：试剂盒的使用[0112]1、样品检测

[0113]按照模板数配制体系：取PCR反应液，加入对应混合液、空白 对照品，加入样品DNA、空白对照品或阳性对照品为模板，组成PCR 反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。[0114]PCR体系各主要成分如下：[0115]表13.PCR体系各主要成分

12

CN 108277269 A[0116]

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[0117]

[0118][0119][0120]

该体系反应程序如下：表14.PCR反应程序

2、ABI7500荧光定量PCR

[0122]按下右端开机键，启动ABI 7500。开机后机器左端“power”指 示灯长亮。打开仓门，将配好的试剂放入仓内，记好自己摆放的位置。[0123]1)双击“7500 Software v2.0.5”图标打开软件。在弹出的窗口中 点击“OK”进入程序。

[0124]2)单击“New Experiment”，在弹出“Experiment Properties”界 面中依次选中“7500(96wells)”、“Quantitaion-Standad Curve”、 “亮。

3)点击“Plate Setup”，在“Reporter”栏内的下拉选框里选择“FAM”， 在“Quencher”栏内的下拉选框里选择“TAMRA)”，点击“Add New Target”，在“Reporter”栏内的下拉选框里选择“JOE”，在“Quencher” 栏内的下拉选框里选择“TAMRA)”；反复点击“Add New Sample”， 使“Sample Name”下方弹出足够数量的方框，在这些方框内输入各 样本的唯一编号。

13

[0125]

[0121]

Reagents”图标使其变

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4)点击“Assign Targets and Samples”，在“Passive Reference” 栏内的下拉选

框里选择“ROX”，选中试剂所放的孔位，确认与仪器 相对应，在“Assign sample(s)to the selected wells”栏内的方框里打 “√”，在“Assign target(s)to the selected wells”栏内的方框里打“√”， 并点击对应的图标使其变亮：“U”(待测样本)、“S”(阳性对照品)、 “N”(空白对照品)。

[0127]5)反应条件设置：单击“Run Method”进入反应条件设置面板， 制定所需的扩增程序，在“Holding Stage”栏内设置95℃30秒，将 光标移至“Cycling Stage”栏，在第1节“Step 1”中设置95℃10 秒，在“Step 2”中设置60℃30秒，并在该节中点击荧光采集图标 使其变亮，在“Number of Cycles”栏内输入45，并在“Reaction Volume Per Well”栏内输入25。

[0128]

6)确认无误后，点击“START R…”对当次PCR编号并保存在 对应的文件夹，点击确

定，开始运行。开始后会有一段预热，正式开 始循环时“IN USE”指示灯闪烁。[0130]7)运行完后，打开仓门，将产物倒入垃圾桶，填写仪器使用记 录等。[0131]3、结果判断[0132]反应结束后，进行自动调整基线和阈值。设定之后，点击“Analyse” (分析)按键，即可从“View Well Table”窗口的“Ct”处得到各样 本的Ct值。[0133]4、质控标准

[0134]对于VKORC1-1639：配有PCR反应液1的反应管Ct值定为Ct1， 配有PCR反应液2的反应管Ct值定为Ct2，ΔCt＝Ct2-Ct1；[0135]对于CYP2C9*2：配有PCR反应液3的反应管Ct值定为Ct3， 配有PCR反应液4的反应管Ct值定为Ct4，△Ct＝Ct4-Ct3；[0136]对于CYP2C9*3：配有PCR反应液5的反应管Ct值定为Ct5， 配有PCR反应液6的反应管Ct值定为Ct6，△Ct＝Ct6-Ct5；[0137]阳性对照品的Ct≤32，-2≤△Ct≤3.4；[0138]空白对照品无S型扩增曲线或无Ct值显示；[0139]以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效。[0140]5、结果报告：

[0141]对于待检测样品：[0142]1)若Ct﹥32，说明DNA质量太低，需要重新提取DNA或更换 样本；[0143]2)若Ct≤32，即对于ΔCT绝对值>11的样本定义为相应的纯合 子，-2≤ΔCT≤3.4

[0129]

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的样本定义为相应的杂合型。而3.4＜ΔCT≤11 或-11≤ΔCT＜-2的样本则需要重做试验进行复核，重做结果一致， 则认定为取样过程或样本处理过程存在污染，需要重新取样。[0144]图1显示的是临床检测结果中VKORC1-1639的野生型，图2显 示的是临床检测结果中VKORC1-1639的突变杂合型，图3显示的是 临床检测结果中VKORC1-1639的突变纯合型，图4、图5分别显示 的是临床检测结果中的阳性对照品和空白对照品的荧光曲线图。图1 反应液1中FAM曲线Ct1值为25.69，反应液2中FAM曲线无Ct1 值，△Ct＞11判定为VKORC1-1639野生型。图2反应液1中FAM 曲线Ct1值为26.8，反应液2中FAM曲线Ct2值为26.44，△ Ct＝26.8-26.44＝0.36，-2≤ΔCT≤3.4判定为VKORC1-1639突变杂合 型。图3反应液1中FAM曲线无Ct1值，反应液2中FAM曲线Ct2 值为25.22，△Ct＞11判定为VKORC1-1639突变纯合型。图4反应 液1和2的FAM曲线均有CT值，JOE曲线也均有CT值。图5反应 液1和2的FAM曲线均无CT值，JOE曲线也均无CT值。

[0145]图6和图9分别显示的是临床检测结果中CYP2C9*2、CYP2C9*3 的野生型，图7和图10分别显示的是临床检测结果中CYP2C9*2、 CYP2C9*3的突变杂合型，图8和图11分别显示的是临床检测结果 中CYP2C9*2、CYP2C9*3的突变纯合型，图12和图13分别显示的 是CYP2C9临床检测结果中的阳性对照品和空白对照品的荧光曲线 图。图6反应液3中FAM曲线Ct3值为28.12，反应液4中FAM曲 线无Ct4值，△Ct绝对值＞11判定为CYP2C9*2野生型。图7反应 液1中FAM曲线Ct3值为31.50，反应液2中FAM曲线Ct4值为31.74， △Ct＝31.74-31.50＝0.24，-2≤ΔCT≤3.4，判定为CYP2C9*2突变杂合 型。图8反应液3中FAM曲线无Ct3值，反应液4中FAM曲线Ct4 值为25.88，△Ct绝对值＞11判定为CYP2C9*2突变纯合型。图9反 应液5中FAM曲线Ct5值为26.14，反应液6中FAM曲线无Ct6值， △Ct绝对值＞11判定为CYP2C9*3野生型。图10反应液5中FAM 曲线Ct5值为26.，反应液5中FAM曲线Ct6值为28.81，△ Ct＝28.81-26.＝2.17，-2≤ΔCT≤3.4，判定为CYP2C9*3突变杂合型。 图11反应液5中FAM曲线无Ct5值，反应液6中FAM曲线Ct6值 为27.33，△Ct绝对值＞11判定为CYP2C9*3突变纯合型。图12反 应液3-6FAM曲线均有CT值，JOE曲线也均有CT值。图13反应液 3-6AM曲线均无CT值，JOE曲线也均无CT值。

[0146]图14和图15为VKORC1-1639多组设计引物的荧光扩增曲线图； 其中图16的结果均不准确，只有图17的结果真实可靠。

[0147]图16和图17为CYP2C9*2多组设计引物的荧光扩增曲线图；其 中图18的结果均不准确，只有图19的结果真实可靠；

[0148]图18和图19为CYP2C9*3多组设计引物的荧光扩增曲线图；其 中图18的结果均不准确，只有图19的结果真实可靠。

[0149]本发明提供的用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及 试剂盒具有以下有益效果：[0150]一、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度 高和特异性好的引物对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测 VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性时，具有定性 准确，灵敏度高及特异性强的优点；此外，还具有样品处理简单、测 序步骤简单、测序速度快、一个小时完成一次上机反应、直接给出检 测位点荧光曲线及结果直观的优点；

[0151]二、通过利用ARMS结合QPCR技术重新设计并优化了灵敏度 高和特异性好的引物

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对及其试剂盒，使得所述试剂盒在检测 VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多态性时，可实时监 测反应进程、反应时间短、PCR产物简单处理即可上荧光定量PCR 仪、操作简便及高通量样品检测，并比金标准方法，即毛细管电泳测 序法灵敏度更高，更适合用于突变分析；

[0152]三、通过在所述试剂盒中设置了空白对照品和阳性对照品，使得 所述试剂盒在检测VKORC1-1639、CYP2C9*2和CYP2C9*3基因多 态性时，可以更好的确保检测结果的准确性。[0153]以上所述仅为本发明的实施例，并非因此本发明的专利范围， 凡是利用本发明说明书内容所作的等效流程变换，或直接或间接运用 在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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序列表<110> 长沙三济生物科技有限公司<120> 用于检测华法林用药相关基因多态性的引物对及试剂盒<130> 2017<160> 15<170> SIPOSequenceListing 1.0<210> 1<211> 20<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 1ctcaagtgat ccacccacct  <210> 2<211> 28<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 2tgcggtggct cacgcctata atcctagc  <210> 3<211> 22<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 3cgtcatatac catcatttga cg  <210> 4<211> 22<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 4cgtcatatac catcatttga ca  <210> 5<211> 25<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 5ctatgcatct gtctacaaca gttac  <210> 6<211> 21

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2028222225CN 108277269 A

序　列　表

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<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 6aggaagcccg ctgccttgtg g  21<210> 7<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 7tacatgctca tgtgtatcc  <210> 8<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 8tacatgctca tgtgtatct  <210> 9<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 9cgtgtgattg gcagaaacc  <210> 10<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 10agttcgcagt cctgcgtcac tcgc  <210> 11<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 11agtgcgcagt gacgtctat  <210> 12<211> 19<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 12

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序　列　表

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agtgcgcagt gacgtctag  19<210> 13<211> 21<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 13atcctgggct acactgagca c  21<210> 14<211> 24<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 14ctcagtgtag cccaggatgc cctt  <210> 15<211> 22<212> DNA<213> 人工序列(Artificial Sequence)<400> 15aggtggtctc ctctgacttc aa  19

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