按含碳量：C18、C8优点：稳定不易流失；按填料：球形、无定形缺点：pH得在3~8范围内常用流动相：乙腈、甲醇，水按粒径：150mm*4.6mm,5μm等按应用：分析柱、制备柱、预处理柱
分离机理：“反相色谱”固定相极性小于流动相极性按填料类型：正相柱、反相柱、手性柱
消除硅羟基的不良影响；应用广泛，可使用多种溶剂；
30min
6、流动相：
2、反相色谱：
3、色谱柱的分类：
4、键合相色谱柱的优缺点：
第一部分：HPLC使用注意事项
5、C18柱的活化：90% 10% 90%的甲醇溶液1ml/min依次冲洗
1、HPLC组成：泵、进样器、色谱柱、检测器、数据系统/积分仪
使用之前需超声脱气（PPT18）
药物代谢动力学实验考查知识点整理
目的：色谱泵输液准确
流动相配置：流动相组成：外标法
内标法（准确麻烦）
保护色谱柱流动相使用前脱气。内标物的要求：样品中不存在；
变化和成分分解，影响色谱分离的效果；
化学结构与待测品相似；
流动相脱气的方法：加热，抽真空，超声，通惰性气体缓冲溶液现用现配，不要储存时间过长，避免pH值发生
不与样品组分发生化学反应；
有机溶液和缓冲液使用前均需经0.45μm微孔滤膜过滤；
8、样品的预处理：
7、常用定量方法：
提高检测性能
浓度相当；
与其他色谱峰分离好
保留值与待测值接近；
目的：除杂质；浓缩微量成分；改善分离；保护色谱柱；提
第二部分：实验设计
第三部分：实验相关条件与数据处理
分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水
法、风量下限与标曲范围
有机溶剂：乙腈、甲醇
强酸：三氯乙酸、过氯酸
盐：50%硫酸铵、10%TCA
为获得给药后的一个完整的血药浓度-时间曲线，采样时间点
沉淀蛋白的溶剂：大概范围
取、液液萃取
方法：高速离心，过滤，选择性沉淀，衍生反应；液固萃
度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除
2、分析方法建立：色谱柱、流动相组成、柱温箱温度、样品处理方
1、考虑问题：动物种属、给药剂量、取血时间、采样量、血药浓度
相需要4~6个采样点。整个采样时间至少应持续到3~5
的设计应兼顾药物的吸收相、平衡相（峰浓度附近）和
消除相。一般在吸收相至少需要2~3个采样点，对于吸
收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓
实验一：
1、采血点设计一般原则
高检测灵敏度
C0
6、参数计算
柱温：40℃
公式
由y = 9.511e-0.02 令x=0得
4、采血方式：眼眶静脉丛采血（0.3ml/次）
由曲线线性判断为一房室模型，参数计算如下：
色谱柱：岛津 Shimadzu VP-ODS; 150×4.6; 5μm
个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/20。
流动相：50mM磷酸盐缓冲液（6.8g磷酸二氢钾加入到152mL的
5、蛋白沉淀方式：10%高氯酸，涡旋，15000rpm 10min,取100ul上
物进行预试验，然后根据预试验的结果，审核并修正原
为保证最佳采样点，建议在正式试验前，选择2~3只动
氢氧化钠溶液（0.1mol/L）中，并稀释到1L）：乙腈
由y = 9.511e-0.02 令y=0.5C0得
进样体积：20μL
检测波长：254nm
6、非那西丁色谱条件
3、麻醉：腹腔注射20%乌拉坦
2、动物给药方式：股静脉注射
参数
T1/2
设计的采样点。
（60:40）清二次离心
值
9.511μl/ml
34.66min
k
Vd
CLMRTAUC
k
C0
CL
AUMC
参数
T1/2
MRT
AUC
Vss
实验二：
版本一：
MRT=AUMC/AUC MRT=1/k
Div/AUC=2.5mg/297.14μg.min
由T1/2=0.693/k得
C0=Div/VSS=2.5mg/344.65ml
非房室
获取肝脏：大鼠禁食不禁水24小时后取肝脏，
Vd=X(给药量)/C0 X=1.25ml*2mg/ml=2.5mg
组织匀浆：称重剪成碎块后加入匀浆液制成匀浆，
VSS=Div.AUMC/AUC2=2.5mg*12171.1/297.142
AUC0~100min=278.56 AUC100~∞=C100min/k=18.7 AUC0~100min+ AUC100~∞=278.56+18.7
AUMC0~100min=9030 AUMC100~∞=t100minC100min/k+C100min/k2= 3141.1 AUMC=AUMC0~100min+ AUMC100~∞
1、肝微粒体的制备方法
轻轻冲洗。
由-k/2.303=-0.011
值0.025min-17.253μl/ml
无297.14μg.min12171μg*min2/ml40.96min/40min8.41min-1ml-1344.65ml
CL=k*VdMRT=1/kAUC=X/CL
5.25min-1ml-150.01min480μg.min
0.02min-1262.8ml
液于100000g离心管中离心20min,弃上清，沉淀用pbs
重悬沉淀：用10ml匀浆液重悬，冻存管分装后置-80℃冰箱内保存
差速离心：匀浆液4℃9000g离心15min，弃去沉淀和脂肪层取上清
版本二：
蛋白定量：BCA法
加 4 倍肝质量的蔗糖溶液, 在冰浴中用组织匀浆机制成匀浆,再超
放入冰冷的蔗糖溶液中清洗, 用剪刀剪成碎块, 反复清洗至无血色。
声分散 30 s, 4 C下 10 000 r/min -离心20 min。 上清液用四层
弃上清液, 沉淀用焦磷酸钾缓冲液悬浮均匀, 在 4 C 下50 000
纱布过滤除漂浮脂物,滤液在 4 C 下 50 000 r/min 离心 60 min,
r/min 离心 60 min, 沉淀即为肝微粒体。用Tris HCl 缓冲液悬
浮均匀, 体积为原上清液的1/ 4 即可, 分装于塑料管中, 于- 80
C保存, 采用Lowry 法测定肝微粒体蛋白浓度
大鼠拉颈椎处死, 开腹取肝脏, 用滤纸吸干水分, 称质量。立即
版本三：
5min,
葡萄糖- 6- 磷酸(G- 6- P)<10mM>
葡萄糖 －6 － 磷酸脱氢酶(G- 6- P- OH) <1U/mL>
2、NADPH体系:
3、温孵实验步骤：
β-NADP+ <0.5mM>
氯化镁 5Mm
肝微粒体（0.2mg/mL,80μL），非那西丁溶液,37℃水浴预温孵
加入冰甲醇（终止试剂，100μL），终止温孵,
涡旋1min，高速离心（12000r/min）10min，转移上清液200μl
加入NADPH体系溶液（启动剂，40μL），37℃水浴温孵，30min,
4、数据处理
双倒数法1/V的截距为1/Vmax, 1/[S]
的截距为-1/ Km
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