在发酵工业中，绝大多数是利用好气性微生物进行纯种培养，空气则是微生物生长和代谢必不可少的条件。但空气中含有各种各样的微生物，这些微生物随着空气进入培养液，在适宜的条件下，它们会迅速大量繁殖，消耗大量的营养物质并产生各种代谢产物；干扰甚至破坏预定发酵的正常进行，使发酵产率下降，甚至彻底失败。因此，无菌空气的制备就成为发酵工程中的一个重要环节。空气净化的方法很多，但各种方法的除菌效果、设备条件和经济指标各不相同。实际生产中所需的除菌程度根据发酵工艺要求而定，、既要避免染茵，又要尽量简化除菌流程，以减少设备投资和正常运转的动力消耗。本章将讨论合理选择除菌方法，决定除菌流程以及选用和设计满足生产需要的除菌设备等。
第一节 空气中微生物的分布和发酵工业对空气无菌程度的要求
一、无菌空气的概念发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。 二、空气中微生物的分布
通常微生物在固体或液体培养基中繁殖后，很多细小而轻的菌体、芽孢或孢子会随水分的蒸发、物料的转移被气流带入空气中或粘附于灰尘上随风飘浮，所以空气中的含菌量随环境不同而有很大差异。一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少，而潮湿温暖的南方则含菌量较多；人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多；地面又比高空的空气含菌量多。因此，研究空气中的含菌情况，选择良好的采风位置和提高空气系统的除菌效率是保证正常生产的重要内容。
各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103~104个／m3进行计算。
三、发酵对空气无菌程度的要求
各种不同的发酵过程，由于所用菌种的生长能力、生长速度、产物性质、发酵周期、基质成分及pH值的差异，对空气无菌程度的要求也不同。如酵母培养过程，其培养基以糖源为主，能利用无机氮，要求的pH值较低，一般细菌较难繁殖，而酵母的繁殖速度又较快，能抵抗少量的杂菌影响，因此对无菌空气的要求不如氨基酸、抗生素发酵那样严格。而氨基酸与抗生素发酵因周期长短不同，对无菌空气的要求也不同。总的来说，影响因素是比较复杂的，需要根据具体情况而订出具体的工艺要求。一般按染菌机率为10-3。来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许1~2次染菌。 虽然一般悬浮在空气中的微生物，大多是能耐恶劣环境的孢子或芽孢，繁殖时需要较长的调整期。但是在阴雨天气或环境污染比较严重时，空气中也会悬浮大量的活力较强的微生物，它进入培养物的良好环境后，只要很短的调整期，即可进入对数生长期而大量繁殖。一般细菌繁殖一代仅需20~30min，如果进入一个细菌，则繁殖15h后，可达109个。如此大量的杂菌必使发酵受到严重干扰或失败，所以计算是以进入1、2个杂菌即失败作为依据的。
四、空气含菌量的测定
空气是许多气态物质的混合物，主要成分是氮气和氧气，还有惰性气体及二氧化碳和水蒸汽。除气体外，尚有悬浮在空气中的灰尘，而灰尘主要由构成地壳的无机物质微粒、烟灰和植物花粉等组成。一般城市灰尘多于农村，夏天多于冬天，特别是气候温和湿润地区，空气中的菌量较多。据统计，大城市每立方米空气中的含菌数约为3000~10000个。要准确测
定空气中的含菌量来决定过滤系统或查定过滤空气的无菌程度是比较因难的。一般采用培养法和光学法测定其近似值。前者在微生物学中已有介绍，后者系用粒子计数器通过微粒对光线的散射作用来测量粒子的大小和含量。这种仪器可以测量空气中直径为0．3~0.5μm微粒的各种浓度，比较准确，但它只是微粒观念，不能反映空气中活菌的数量。
第二节 空气除菌方法
大多数需氧发酵是通入空气进行的。在使用之前必须加以处理以除去其中的有害成分。对空气的要求随发酵类型不同而导，厚层固体曲需要的空气量大，压力不高，无菌度不严格，一般选用离心式通风并经适当的空调处理(温、湿)就可以了。酵母培养消耗空气量大，无菌度也不十分严格，但需要一定压力以克服发酵罐的液柱阻力，所以一船采用罗茨鼓风机或高压离心式鼓风机通风。而对于密闭式深层好气发酵则需要严格的无菌度，必须经过除菌措施，由于空气中含有水分和油雾杂质，又必须经过冷却、脱水、脱油等步骤，因此，无菌空气的制备须经过一个复杂的空气处理过程。同时，为了克服设备和管道的阻力并维持一定的罐压，需采用空气压缩机。
发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。生产上使用的空气量大，要求处理的空气设备简单，远行可靠，操作方便，现就各种除菌方法简述如下：
一、辐射灭菌
α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。但应用较广泛的还是紫外线，它在波长为2265~3287A时杀菌效力最强，通常用于无菌室和医院手术室。但杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。
二、加热灭菌
虽然空气中的细菌芽孢是耐热的，但温度足够高也能将它破坏。例如悬浮在空气中的细菌芽孢在218°C下24s就被杀死。但是如果采用蒸汽或电热来加热大量的空气，以达到灭菌目的，这样太不经济。利用空气压缩时产生的热进行灭菌对于无菌要求不高的发酵来说则是一个经济合理的方法。
利用压缩热进行空气灭菌的流程见图7-1(a)。空气进口温度为21°C，出口温度为187~198°C，压力为0.7MPa。压缩后的空气用管道或贮气罐保温一定时间以增加空气的受热时间，促使有机体死亡。为防止空气在贮罐中走短路，最好在罐内加装导筒。这种灭菌方法已成功地运用于丙酮丁醇、淀粉酶等发酵生产上。图7-1(b)是一个用于石油发酵的无菌空气系统，采用涡轮式空压机，空气进机前利用压缩后的空气进行预热，以提高进气温度并相应提高排气温度，压缩后的空气用保温罐维持一定时间。
采用加热灭菌法时，要根据具体情况适当增加一些辅助措施以确保安全。因为空气的导热系数低，受热不很均匀，同时在压缩机与发酵罐间的管道难免有泄漏，这些因素很难排除，因此通常在进发酵罐前装一台空气分过滤器。
图7-1 利用空压机所产生的热来进行灭菌
三、静电除菌
近年来一些工厂巳使用静电除尘器除去空气中的水雾、油雾和尘埃，同时也除去了空气中的微生物。对Iμm的微粒去除率达99％，消耗能量小，每处理1000m3的空气每小时只耗电0.4~0.8kW。空气的压力损失小，一般仅(3~15)×133.3Pa。但对设备维护和安全技术措施要求较高。
静电防尘是利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。悬浮于空气中的微生物，其孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒。但对于一些直径很小的微粒，它所带的电荷很小，当产生的引力等于或小于气流对微粒的拖带力或微粒布朗扩散运动的动量时，则微粒就不能被吸附而沉降，所以静电除尘对很小的微粒效率较低。
静电除菌装置按其对菌体微粒的作用可分成电离区和捕集区。管式静电除尘器如图7-2所示。
图7-2 静电除尘器
1-钢丝（电晕电极）；2-钢管（沉淀电极）；3-高压绝缘瓷瓶；4-钢板；5-空气出口；6-封头；7-钢板；8-法兰；9-空气出口。
用静电除菌净化空气有如下优点： (1)阻力小，约1.01325×104Pa； (2)染菌率低，平均低于10~15％； (3)除水、除油的效果好； (4)耗电少。
缺点是设备庞大，需要采用高压电技术，且一次性投资较大；对发酵工业来说，—其捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。
四、介质过滤
介质过滤是目前发酵工业上常使用的空气除菌方法。它采用定期灭菌的干燥介质来阻截流过的空气中所含的微生物，从而制得无菌空气。常用的过滤介质有棉花；活性炭或玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等。由于被过滤的气溶胶中微生物的粒子很小，一般只有0.5~2μm，而过滤介质的材料一般孔径都大于微粒直径几倍到几十倍，因此过滤机理比较复杂。
随着工业的发展，过滤介质逐渐由天然材料棉花过渡到玻璃纤维、超细玻璃纤维和石棉板、烧结材料(烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料)、微孔超滤膜等。而且过滤器的形式也在不断发生变化，出现了一些新的形式和新的结构，把发酵工业中的染菌控制在极小的范围。
第三节 过滤除菌的机理
目前发酵工厂采用的空气过滤设备大多数是深层过滤器和玻璃纤维过滤纸过滤器，所用的过滤介质一般是棉花、活性炭，也有用玻璃纤维、焦炭和超细玻璃纤维、维尼龙等。对不同的材料、不同规格、不同填充情况，都会得到不同的过滤效果
空气溶胶的过滤除菌原理与通常的过滤原理不一样，一方面是由于空气溶胶中气体引力较小，且微粒很小，常见悬浮于空气中的微生物粒子在0．5~2μm之间，深层过滤所用的过滤介质----棉花的纤维直径一般为16~ 20μm，填充系数为8％时，棉花纤维所形成的孔隙为20~50μm；超细玻璃纤维滤板因纤维直径很小，为1~1．5μm，湿法抄制紧密度较大，所形成的网格孔隙为0．5~5μm。微粒随气流通过滤层时，滤层纤维所形成的网格阻碍气流直线前进，使气流无数次改变运动速度和运动方向，绕过纤维前进。这些改变引起微粒对滤层纤维产生惯性冲击、重力沉降、阻拦、布朗扩散、静电吸引等作用而将微粒滞留在纤维表面上。
图7-3 单纤维空气流程图
图7-3为一单纤维的流动模型。这是带颗粒的气流流过纤维截面的假想模型。当气流为层流时，气体中的颗粒随气流作平行运动，接近纤维表面的颗粒(即气流宽度为b中的颗粒)；被纤维捕获，而大于b的气流中的颗粒绕过纤维继续前进。因为过滤层是无数层单纤维组成的，所以就增朗了捕获的机会。下面分述颗粒被捕获的作用机理以及它们的大小和关系。
一、惯性捕集作用
在过滤器中的滤层交错着无数的纤维，好像形成层层的网格，随着纤维直径减小，充填密度的增大，所形成的网格就越紧密，网格的层数也就越多，纤维间的间隙就越小。当带有微生物的空气通过滤层时，无论顺纤维方向流动或是垂直于纤维方向流动，仅能从纤维的间隙通过。由于纤维交错所阻迫，使空气要不断改变运动方向和速度才能通过滤层。图14-3中的df为纤维断面的直径，当微粒随气流以一定速度垂直向纤维方向运动时，因障碍物(介质)的出现，空气流线由直线变成曲线，即当气流突然改变方向时，沿空气流线运动的微粒由于惯性作用仍然继续以直线前进。惯性使它离开主导气流；走的是图中虚线的轨迹。气流宽度b以内的粒子，与介质碰撞而被捕集。这种捕集由于微粒直冲到纤维表面，因摩擦粘附，微粒就滞留在纤维表面上，这称为惯性冲击滞留作用。
惯性捕集是空气过滤器除菌的重要作用，其大小取决于颗粒的动能和纤维的阻力，也就是取决于气流的流速。惯性力与气流流速成正比，当流速过低时，惯性捕集作用很小，甚至接近于零；当空气流速增至足够大时，惯性捕集则起主导作用。
纤维能滞留微粒的宽度区间b与纤维直径df之比，称为单纤维的惯性冲击捕集效率ηl。 b的大小由微粒的运动惯性所决定。微粒的运动惯性越大，它受气流换向干扰越小，b
1bdf值就越大。同时，实践证明，捕集效率是微粒惯性力的无因次准数φ的函数：
ηl=f（φ）
准数φ与纤维的直径、微粒的直径、微粒的运动速度的关系为：
cpd3pv018df(1)式中c：层流滑动修正系数；v0：微粒（即空气）的流速，m/s；df：纤维直径，m；dp：微粒直径，m；p：微粒密度，kg/m3；：空气粘度，Pas 由上式可见，空气流速v0是影响捕集效率的重要参数。在一定条件下(微生物微粒直径、
纤维直径、空气温度)，改变气流的流速就是改变微粒的运动惯性力；当气流速度下降时，微粒的运动速度随之下降，微粒的动量减少，惯性力减弱，微粒脱离主导气流的可能性也减少，相应纤维滞留微粒的宽度b减小，即捕集效率下降。气流速度下降到微粒的惯性力不足以使其脱离主导气流对纤维产生碰撞，即在气流的任一处，微粒也随气流改变运动方向绕过纤维前进，即b＝o时，惯性力无因次准数φ＝1/16，纤维的碰撞滞留效率等于零，这时的气流速度称为惯性碰撞的临界速度vc。vc是空气在纤维网格间隙的真实速度，它与容器空截
面时空气速度vs的关系受填充密度α的影响。
临界速度vc的值随纤维直径和微粒直径而变化。图14—4表示了几种不同直径的微粒对不同直径纤维的临界速度。
图7-4 空气的临界速度vc
二、拦截捕集作用
气流速度降低到惯性捕集作用接近于零时，此时的气流速度为临界速度。气流速度在临界速度以下时，微粒不能因惯性滞留于纤维上，捕集效率显著下降。但实践证明，随着气流速度的继续下降，纤维对微粒的捕集效率又回升，说明有另一种机理在起作用，这就是拦截捕集作用。
微生物微粒直径很小，质量很轻，它随低速气流流动慢慢靠近纤维时，微粒所在的主导气流流线受纤维所阻，从而改变流动方向，绕过纤维前进，而在纤维的周边形成一层边界滞流区。滞流区的气流速度更慢，进到滞流区的微粒慢惕靠近和接触纤维而被粘附滞留，称为拦截捕集作用。拦截捕集作用对微粒的捕集效率与气流的雷诺准数和微粒与纤维直径比的关系，可以总结成下面的经验公式：
2112(1R)ln(1R)(1R)2(2.00lnRe)1Rdp式中R：微粒和纤维的直径比，R；dfdp：微粒直径，m；df：纤维直径，m；Re：气流的雷诺准数。Redfv(2)此公式虽然不能完善地反映各参数变化过程纤维截留微粒的规律，但对气流速度等于或
小于临界速度时计算得的单纤维截留效率还是比较接近实际的。
3，扩散捕集作用
直径很小的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则的运动，称为布朗扩散。扩散运动的距离很短，在较大的气流速度和较大热纤维间隙中是不起作用的，但在狠慢的气流速度和较小的纤维间隙中，扩散作用大大增加了微粒与纤维的接触机会，从而被捕集。
设微粒扩散运动的最大距离为2x，则离纤维2x处气流中的微粒都可能因扩散运动与纤维接触，滞留在纤维上，这就增加了纤维的捕集效率。扩散捕集效率的计算可用拦截捕集的经验公式计算，但其中微粒的直径应以扩散距距离代入计算，故得下式：
12x2x2x12(1)ln(1)(1)32x2(2.00lnRe)dfdfdf1df2x13式中1.122(2.00lnRe)BM/vdf；df(3)BM：微粒扩散率K：波尔曼常数；T：绝对温度，K。BMcKT/3dp；三、重力沉降作用
微粒虽小，但仍具有重力。当微粒重力超过空气作用于其上的浮力时，即发生一种沉降加速度。当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就发生沉降现象。就单一重力沉降而言，大颗粒比小颗粒作用显著，一般50μm以上的颗粒沉降作用才显著。对于小颗粒只有气流速度很慢时才起作用。重力沉降作用一般是与拦截作用相配合，即在纤维的边界滞留区内。微粒的沉降作用提高了拦截捕集作用。
5，静电吸附作用
图7-5 单纤维除菌总效率和气流速度的关系
干空气对非导体的物质作相对运动摩擦时，会产生静电现象，对于纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。悬浮在空气中的微生物大多带有不同的电荷。有人测定微生物孢子带电情况时发现，约有75％的孢子具有l~60负电荷单位，15％的孢子带有5~14正电荷单位，其余10％则为中性，这些带电荷的微粒会被带相反电荷的介质所吸附。此外，表面吸附也属这个范畴，如活性炭的大部分过滤效能应是表面吸附作用。
上述机理中，有时很难分辨是哪一种单独起作用。图7-5是单纤维除菌总效率ηs(包括惯性、扩散、拦截等作用)与气流速度的关系。总的来说，当气流速度较大时(约大于0.1m/s)，惯性捕集是主要的。而流速较小时，扩散作用占优势。前者的除菌效率随气流速度增加而增加，后者则相反。而在两者之间，在ηs极小值附近，可能是拦截作用占优势。
以上几种作用机理在整个过程中，随着参数变化有着复杂的关系，目前还未能作准确的理论计算。
第四节 空气过滤除菌的流程
一、空气净化的工艺要求
空气过滤除菌流程是生产对无菌空气要求具备的参数(如无菌程度、空气压力、温度等)，并结合吸气环境的空气条件和所用空气除菌设备的特性，根据空气的性质而制订的。
对于一般要求的低压无菌空气，可直接采用一般鼓风机增压后进入过滤器，经一、二次过滤除菌而制得。如无菌室、超净工作台等用作层流技术的无菌空气就是采用这种简单流程。自吸式发酵罐是由转子的抽吸作用使空气通过过滤器而除菌的。而一般的深层通风发酵，除要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还要具有一定高的压力，这就需要比较复杂的空气除菌流程。
供给发酵用的无菌空气，需要克服介质阻力、发酵液静压力和管道阻力，故一般使用空压机。从大气中吸入的空气常带有灰尘、沙土、细菌等；在压缩过程中，又会污染润滑油或管道中的铁锈等杂质。空气经压缩，一部分动能转换成热能，出口空气的温度在120~160°C之间，起到一定的杀菌作用，但在空气进入发酵罐前，必须先行冷却；而冷却出来的油、水，又必须及时排出，严防带入空气过滤器中，否则会使过滤介质(如棉花等)受潮，失去除菌性能。空气在进入空气过滤器前，要先经除尘、除油、除水，再经空气过滤器除菌，制备净化空气送入发酵罐，供菌体生长与代谢的需要。
(1)首先将进入空压机的空气粗滤，滤去灰尘、沙土等固体颗粒。这样还有利于空压机的正常运转，提高空压机的寿命。
(2)将经压缩后的热空气冷却，并将析出的油、水尽可能地除掉。常采用油水分离器与去雾器相结合的装置。
(3)为防止往复压缩机产生脉动，和一般的空气供给一样，流程中需设置一个或数个贮气罐。
(4)空气过滤器一般采用二台总过滤器(交叉使用)和每个发酵罐单独配备分过滤器相结合的方法，。以达到无菌。
二、过滤除菌的一般流程
空气过滤除菌一般是把吸气口吸入的空气先进行压缩前过滤，然后进入空气压缩机。从空气压缩机出来的空气(一般压力在0.2MPa以上，温度120~160°C)，先冷却至适当温度(20~25°C)除去油和水，再加热至30~35°C，最后通过总空气过滤器和分过滤器(有的不用分过滤器)除菌，从而获得洁净度、压力、温度和流量都符合工艺要求的灭菌空气。一般，空气净化采取如图7-6所示的工艺流程。
在上述工艺过程中，各种设备系围绕两个目的：一是提高压缩前空气的质量(洁净度)；另一个是去除压缩空气中所带的油和水。
1，提高压缩前空气的质量
主要措施是提高空气吸气口的位置和加强吸入空气的压缩前过滤。
(1)空气吸气口
提高空气吸气口的高度可以减少吸入空气的微生物含量。据报道，吸气口每提高3．05m，微生物数量减少一个数量级。由于空气中的微生物数量因地区、气候而不同；因此吸气口的高度也必须因地制宜，一般以离地面5~10m为好。在吸气口处需要设置防止颗粒及杂物吸入的筛网(也可以装在粗过滤器上)，以免损坏空气压缩机。如果将粗过滤器提高到相当于吸气口的高度，则不需另设吸气口。
(2)粗过滤器
吸入的空气在进入压缩机前先通过粗过滤器过滤，可以减少进入空气压缩机的灰尘和微生物，减少往复式空气压缩机活塞和气缸的磨损，减轻介质过滤除菌的负荷。常用的粗过滤器有油浸铁丝网、泊浸铁环和泡沫塑料等。 2，去除压缩空气中所带的油和水
空气中的微生物通常不单独游离存在，而依附在尘埃和雾滴上。因此，空气进入压缩机前应尽量除去尘埃和雾滴。空气中的雾滴不仅带有微生物，还会使空气过滤器中的过滤介质受潮而降低除菌效率，以及使空气过滤器的阻力增加。为此，必须设法使进入过滤器的空气保持相对湿度在50~60％左右。从空气压缩机出来的空气，温度为120°C(往复式压缩机)或150°C(涡轮式压缩机)，其相对湿度大大降低，如果在此高温下就进入空气过滤器过滤，可以减少压缩空气中夹带的水分，使过滤介质不致受潮。但是一般的过滤介质耐受不了这样高的温度。因此，压缩空气一般先通过冷却，降低温度，提高空气的相对湿度，使其达到饱和状态并处于露点以下，使其中的水分凝结为水滴或雾沫，从而将它们分离除去。冷却去水后，再将压缩空气加热，降低其相对湿度，使其未除去的水分不致凝结出来，然后进行过滤。
空气通过往复式压缩机的气缸后缩带来的油雾滴，同样会粘附微生物，降低过滤器的除菌效率及使过滤阻力增大，但通过冷却后可以和水一起分离除去。如果往复式压缩机采用半无油润滑或无油润滑，则可以大大降低压缩空气的油雾含量。现将去除油、水的工艺过程所需设备及其作用概述如下。
（1）一级空气冷却器 用30°C左右的水，把从压缩机出来的120°C或150°C的空气冷却到40~50°C左右。 （2）二级空气冷却器 用9°C冷冻水或15~18°C地下水，把40~50°C的空气冷却到20~25°C。冷却后的空气，其相对湿度提高到100%，由于温度处于露点以下，其中的油、水即凝结为油滴和水滴。
（3）空气贮罐
用以沉降大的油滴和水滴及稳定压力。 （4）旋风分离器
用以分离50μm以上的液滴及部分较小的液滴。 （5）丝网除沫器
用以分离5μm以上的液滴。使用丝网除沫器需控制好空气的流速，并不断去掉凝结下来的油水。在空气压力为0.2Mpa（表压）的情况下，最佳的空气流速应为1~2m／s(空床速度)，在此操作条件下可以去掉较小的雾滴。
（6）空气加热器
分离油、水以后的空气的相对湿度仍然为100％，当温度稍微下降时(例如冬天或过滤器阻力下降很大时)就会析出水来，使过滤介质受潮。因此，还必须使用加热器来提高空气温度，降低空气的相对湿度(要求在60％以下)，以免析出水来。
除空气预处理外，影响空气除菌的重要因素还有空气过滤器的过滤介质及操作。
第五节 介质过滤除菌的设备及计算一、深层过滤效率和过滤器的计算
过滤效率就是滤层所滤去的微粒数与原来微粒数的比值，它是衡量过滤器过滤能力的指标：
N1N2N1式中
(4)N1：过滤前空气中的微粒含量；N2：过滤后空气中的微粒含量。N2／Nl：过滤前后空气中的微粒含量比值，即穿透滤层的微粒数与原有微粒数的比值，
称为穿透率。
实践证明，空气过滤器的过滤效率主要与微粒的大小、过滤介质的种类和规格(纤维直径)、介质的填充密度、介质层厚度以及气流速度等因素有关。
1，对数穿透定律
研究过滤器的过滤规律时，先排除一些复杂的因素，假定：
(1)过滤器中过滤介质每一纤维的空气流态并不因其它邻近纤维的存在而受影响； (2)空气中的微粒与纤维表面接触后即被吸附，不再被气流带走； (3)过滤器的过滤效率与空气中微粒的浓度无关；
(4)空气中的微粒在滤层中递减均匀，即每一纤维薄层除去同样百分率的菌体。这样，空气通过单位滤。层后，微粒浓度下降量与进入此介质的空气中的微粒浓度成正比，即：
上式称为对数穿透定律，它表示进入滤层的微粒数与穿透滤层的微粒数之比的对数是滤层厚度的函数。N2/N1称为微粒通过介质的穿透率，以P表示，则介质层过滤效率η用l—P表示。所以式（6）也可写成：
2，介质层厚度的计算 根据对数定律式（6）、式(7)得：
式中的N1可根据进口空气的菌体浓度、空气流量及持续使用时间算出。如空气中的原始菌浓度为10000个／m3，空气流量为200m3／min，持续使用2000h，则N1为2．4×1011个菌，N2一般可假定为10-3个菌，即在规定使用时间内透过一个菌的机滤为千分之一。于是N1/N2＝2.4×1014，在设计空气过滤器时，我们常把Nl/N2＝1015作为设计指标。
式(10)中的K值与纤维介质的性质、直径、填充率、气流速度以及菌体大小有关，K值可以从下式求得：
对数穿透定律是以四点假定为前提推导出来的。实践证明，对于较薄的滤层是符合实际的，但随着滤层的增加，产生的偏差就大。空气在过滤时，微粒含量沿滤层而均匀递减，故K’值为常数。但实际上，当滤层较厚时，递减就不均匀，即K’值发生变化，滤层越厚，K’值变化越大。这说明对数穿透定律不够完善，需要校正。
3，过滤压力降
空气通过过滤层需要克服与介质的摩擦而引起的压力降，ΔP是一种能量损失，损失随滤层的厚度、空气的流速、过滤介质的性质、填充情况而变化，可用下式计算：
由式(2)和式(13)可见，过滤常数或过滤效率随介质的填充率及单纤维过滤效率的增加而增加，随纤维直径的增加而下降。然而单纤维过滤效率，根据图7-4，则随气体流速的增加而增加，也随纤维直径的增加而减少。由此可见，要用一定高度的介质过滤器取得较大的除菌效率，应选用纤维较细而填充率较大的介质，并采用较大的气流速度。但随着填充率及气流速度的增大及纤维直径的减小，通过介质层的阻力(即压力降)将增加，使空压机的出口压力受到影响。阻力过大，还容易导致介质层被吹翻。而气流速度过大，摩擦过激，则会引起某些介质(如活性炭、棉花等)的焚化。
二、计算举例（自学）
参见《发酵工程与设备》p98 三、空气过滤器与过滤介质
过滤介质是过滤除菌的关键，它的好坏不但影响到介质的消耗量、动力消耗(压力降)、劳动强度、维护管理等，而且决定设备的结构、尺寸，还关系到运转过程的可靠性。迄今用得比较多的纤维过滤器是用棉花或玻璃纤维结合活性炭作为过滤介质的过滤器。但这种过滤器存在不少缺点：（l）设备庞大；(2)介质耗量大；(3)阻力大，（4）更换拆装不方便；（5）劳动强度大等。近年来很多研究者按不同的作用机理寻求新的过滤介质，并测试其过滤性能，如超细玻璃纤维、其它合成纤维、微孔烧结材料和超滤微微孔薄膜等。
1，空气过滤器
(1)纤维状及颗粒状介质过滤器
图7-7是深层棉花、活性炭过滤器的结构。
以纤维状或颗粒状介质层为滤床的过滤器为立式圆筒形，内部填充过滤介质，以达到除菌的目的。
空气过滤器的尺寸主要是确定过滤器的内径D和有效过滤的高度，最后定出整个过滤器的高度尺寸。过滤器的内径D可以根据空气量及流速求出：
流速一般取0.2~0.5m／s，按操作情况而定，尽量使过滤器在较高过滤效率的气流速度区运行。通过过滤器的压力降一般为0.02~0.05MPa。目前有的过滤器控制的流速较低仅为0.1~0.2m/s，相应的压力降也较小。
过滤器的有效过滤介质高度L的决定，一般在实验数据的基础上，按对数穿透定律进行计算。但由于滤层太厚，耗用棉花太多，安装困难，阻力损失很大，故工厂常用活性炭作间层，以改善这些因素。这本来是不符合计算要求的。通常总的高度L中，上下棉花层厚度为总过滤层的1/4~1/3，中间活性炭层为1/2~l/3，在铺棉花层之前先在下孔板铺上一层30~40目的金属丝网和织物(如麻布等)，使空气均匀进入棉花滤层。填充物的装填顺序如下：
孔板→铁丝网→麻布→棉花→麻布→活性碳→麻布→棉花→麻布→铁丝网→孔板
装填介质时要求紧密均匀，压紧一致。压紧装置各厂不一，可以在周边固定螺栓压紧，可以用中央螺栓压紧，也可以利用顶盖的密封螺栓压紧，其中利用顶盖压紧比较简便。有些工厂为了防止棉花受潮下沉后松动，在压紧装置上加装缓冲弹簧，弹簧的作用是保持在一定的位移范围内对孔板的—定压力。
在填充介质区间的过滤器圆筒外部有装夹套的，夹套的作用是在消毒前后对过滤介质加热，在北方也可以作为冬天温度太低时保温用。如果仅作为消毒后吹干的加热用，则对直径大的过滤器来说效果很低，热量很难从周边传到过滤器中部。同时使用温度也要十分小心控制，温度过高，则容易使棉花焦化而局部丧失过滤效能，甚至有烧焦着火的危险。
空气一般从下部圆筒切线方向通入，从上部圆筒切线方向排出，以减少阻力损失，出口不宜安装在顶盖，以免检修时拆装管道困难。
过滤器上方应装有安全阀、压力表，罐底装有排污孔，以便经常检查空气冷却是否完全，过滤介质是否潮湿等。
(2)平板式纤维纸分过滤器
这种过滤器是适应充填薄层的过滤板或过滤纸，其结构如图7-8所示。它由简身、顶盖、滤层、夹板和缓冲层构成。空气从筒身中部切线方向进入，空气中的水雾、油雾沉于筒底，由排污管排出，空气经缓冲层通过下孔板经薄层介质过滤后，从上孔板进入顶盖经排气孔排
出。缓冲层可装填棉花、玻璃纤维或金属丝网等。顶盖法兰压紧过滤孔板并用垫片密封，上下孔板用螺栓连接，以夹紧滤纸和密封周边。为了使气流均匀进入和通过过滤介质，在上下孔板应先铺上30~40目的金属丝网和织物(麻布)，使过滤介质(滤板或滤纸)均匀受力，夹紧于中间．周边要加橡胶圈密封切勿让空气走短路。过滤孔板既要承受压紧滤层的作用，也要承受滤层两边的压力差，孔板的开孔一般为5~10mm，孔的中心距为10~20mm。
过滤器的直径可由式(14.14)确定，空气在过滤器内的流速为0.5~1.5m/s，且阻力很小，未经树脂处理的单张滤纸在空气流速为3.6m/s时仅为29．4Pa(3mmHg)。经树脂处理或混有木浆的滤纸。阻力稍太。
(3)管式过滤器
平板式过滤器过滤面积局限于圆筒的截面积。当过滤面积要求较大时，则设备直径很大。若将过滤介质卷装在孔管上，如图14-9所示，这样，总的过滤面积要比平板式大很多。但港装滤纸时要防止空气从纸缝走短路，这种过滤器的安装和检查比较困难。为了防止孔管密封的底部死角积水，封管底盖要紧靠滤孔。
(4)折叠式低速过滤器
在一些要求过滤阻力损失很小，过滤效率比较高的场合，如洁净工作台、洁净工作室或自吸式发酵罐等，都需要设计、生产一些低速过滤器来满足它们的需要。超细纤维纸的过滤特性是气流速度越低，过滤效率越高。为了将很大的过滤面积安装在较小体积的设备内，可将长长的滤纸折成瓦楞状，安装在楞条支撑的滤框内，滤纸的周边用环氧树脂与滤框粘结密封。滤框有木制和铝制两种规格，需要反复杀菌的应采用铝制滤框，使用时将滤框用螺栓固定压紧在过滤器内，底部用垫片密封。
选择过滤器时，应按通过空气的体积流量和流速进行计算。一般选择流速在0．025m／s以下，这时通过的压力损失约为20×133．3Pa。超细纤维的直径很小，间隙很窄，容易被微粒堵塞孔隙而增大压力损失。为了提高过滤器的过滤效率和延长滤芯寿命，一般都加中效过滤设备，或采用静电除尘配合使用。目前，我国一般采用玻璃纤维或泡沫塑料的中效过滤器配合使用；这样较大的微粒和部分小微粒被中效过滤器滤去，以减少高效过滤表面的微
粒堆积和堵塞过滤网格的现象。当使用时间较长，网格堵塞，阻力增大到40mmHg时，就应该更换新的滤芯。 2，空气过滤介质
空气过滤介质不仅要求除菌效率高，还要求能用高温灭菌、不易受油水沾污而降低除菌效率；阻力小、成本低、来源充足、经久耐用及便于调换操作。常用的空气过滤介质有棉花和活性炭(总过滤器及分过滤器)、玻璃棉和活性炭(一级过滤)、超细玻璃纤维纸(一般用于分过滤器)、石棉滤板(分过滤器)等。据测定，超细玻璃纤维纸的除菌效率最好，但易为油、水所沾污。在空气预处理较好的情况下，采用超细玻璃纤维纸作为总过滤器及分过滤器的过滤介质，染菌率很低，但在空气预处理较差的情况下，其除菌效率往往受影响。棉花和活性炭过滤器，因介质层厚、体积大、吸油水的容量大，受油、水影响要比超细玻璃纤维纸好一些，但是这种过滤器调换过滤介质时劳动条件差。因此，改进空气净化的前处理工艺，用超细玻璃纤维纸或其它介质来代替棉花、活性炭是有待解决的问题。
新的过滤介质还有烧结材料、多孔材料等高效滤菌材料。目前试用烧结金属板、烧结金属管作为分过滤器和总过滤器的过滤介质已取得初步效果，还需要进一步试验。此外，近年来出现的微孔过滤介质，如硝酸纤维酯类和聚四氟乙烯类微孔滤膜，在有预过滤的情况下，能绝对过滤干燥或潮湿的空气中平均直径大于孔径(推荐用0.2μm)的微生物，这是一类值得重视的新型过滤介质。
3，空气过滤器的操作要点
为了使空气过滤器始终保持干燥状态，当过滤器用蒸气灭菌时，应事先将蒸汽管和过滤器内部的冷凝水放掉，灭菌蒸汽的压力应保持在0．17—0．2MPa(表压)。开始时先将夹套预热(有的空气过滤器无夹套则不需预热)，然后将蒸汽直接冲入介质层中：小型过滤器的灭菌时间约为半小时，蒸汽从上向下冲；大型过滤器的灭菌时间约为l h，蒸汽一般先从下向上冲半小时，再从上向下冲半小时。过滤器灭菌后应立即引入空气，以便将介质层内部的水分吹出，但温度不宜过高，以免介质被烤焦或焚化。蒸汽压力和排气速度不宜过大，以避免过滤介质被冲翻而造成短路。
在使用过滤器时，如果发酵罐的压力大于过滤器的压力(这种情况主要发生在突然停止进空气或空气压力忽然下降)，则发酵液会倒流到过滤器中来。因此，在过滤器通往发酵罐的管道上应安装单向阀门，操作时必须予以注意。
第七章 生产菌种的扩大培养与保藏
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌
种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。
发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：
（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理形状稳定；
（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染；
（5）保持稳定的生产能力。
第一节 种子的制备过程
在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段： （1）实验室种子制备阶段 （2）生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式：
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。
（一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备
细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。
2，霉菌孢子的制备
霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14天。
3，放线菌孢子的制备
放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为5~14天。
（二）液体种子制备 1，好氧培养
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：
试管→三角瓶→摇床→种子罐
2，厌氧培养
对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下： 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
例如生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2-3天后，再扩大至含有250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培养3-5天即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间，均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以有利与酵母菌的增殖。
二、生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
1，种子罐的作用：
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。
2，种子罐级数的确定
种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； （2）所采用发酵罐的容积。
比如：
细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐
霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵
孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐
放线菌：生长更慢，采用四级发酵
酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子
3，确定种子罐级数需注意的问题
（1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会
（2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会
（3）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
第二节 种子质量的控制
一、影响孢子质量的因素及控制
影响孢子质量的因素通常有：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间等。 1，培养基
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。
水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。
菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。
解决措施：
（1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用； （2）严格控制灭菌后培养基的质量；
（3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间；
（4）供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源。
2，培养条件 （1）温度
温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。
（2）湿度
制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在40%~45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。
表7-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响
相对湿度（%）
16.5~19 25~36 40~45
3，培养时间和冷藏时间 （1）培养时间
一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。
解决措施：
孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。
（2）冷藏时间
斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4℃冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。
冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在
斜面外观
上部稀薄、下部稠略黄 上部薄、中部均匀发白 一片白，孢子丰富，稍皱
活孢子计数（亿/支）
1.2 2.3 5.7
6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。
4，接种量
接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。
二、影响种子质量的因素及控制
生产过程中影响种子质量的因素通常有：孢子的质量、培养基、培养条件、种龄、接种量。
1，培养基
种子培养基要满足以下要求： （1）营养成分适合种子培养的需要
（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； （3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用；
（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高 （5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。 2，培养条件 （1）温度
（2）通气量
在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。
3，种龄
种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。
不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好（见下图）。
4，接种量
接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。
通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%
三、种子质量的控制措施
种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。因此在生产过程中通常进行以下两项检查。
（1）菌种稳定性的检查 （2）无（杂菌）检查
四、种子质量标准
1，细胞或菌体
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）
单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。
2，生化指标
种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。 3，产物生成量
在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。
4，酶活力
种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。
五、种子异常分析
菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁
第三节 实例
一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养
斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐 1，斜面菌种的培养
菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。
(1)斜面培养基组成
葡萄糖 0.1%，蛋白陈 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化钠 0.5%，琼脂 2.0~2.5%，pH 7.0~7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。
(2)培养条件
33~34℃，培养18~24h。 2，一级种子培养
一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。
(1)培养基组成
葡萄糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸镁 0.04%，磷酸氢二钾 0.1%，玉米浆 2.5~3.5%(按质增减)，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，pH7.0。
(2)培养条件
用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次/min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温度33~34℃。
(3)一级种子质量要求 种龄：12h，pH值：6.4±0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查：(-)
镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应。 3，二级种子培养
为了获得发酵所需要的足够数量的菌体，在一级种子培养的基础上进而扩大到种子罐的二级种子培养。种子罐容积大小取决于发酵罐大小和种量比例。
(1)培养基组成 培养基组成（%） 水解糖 玉米浆 磷酸氢二钾 硫酸镁 尿素 Fe++（ppm）
T6-13 2.5 2.5-3.5 0.15 0.04 0.4 2
B9 2.5 2.5-3.5 0.15 0.04 0.4 2
T738 2.5 2.5-3.5 0.2 0.05 0.5 2
AS1.299 2.5 2.5 0.1 0.04 0.5 2
Mn++（ppm） pH
(2)培养条件 接种量：0.8~1.0％ 培养温度：32~34℃ 培养时间：7~8h 通风量：
50L种子罐1:0.5 搅拌转速340r／min； 250L种子罐1:0.3 搅拌转速300r／ min 500L种子罐1:0.25 搅拌转速230r／ min (3)二级种子的质量要求 种龄：7~8h pH：7.2左右 OD值净增0.5左右 无菌检查(-) 噬菌体检查(-)
2 6.8-7.0
2 6.8-7.0
2 7.0
2 6.5-6.8
二、啤酒酵母的扩大培养
一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。
1，实验室扩大培养
2，车间扩大培养
第三节 生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面：从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐；从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
（1）从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种 通常有两种方式
2，从种子罐接种
第四节 菌种的保藏与复壮
一、菌种的保藏
1、菌种保藏的意义
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。2、菌种保藏的原理
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。
一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。
3、菌种保藏的方法 （1）斜面低温保藏法
将菌株接种于合适斜面培养基上，待生长好后置于4冰箱保藏，每隔一定时间进行移接培养后再将新斜面继续保藏。
这种保藏方法简单，存活率高，易于推广，经常使用的菌种可采用这种方法。其缺点是菌种仍有一定强度的代谢活动条件，保存时间不长，而且传代多，因此菌种客易产生变异。
（2）石蜡油封保藏法
将生长好的新鲜斜面在无菌条件下倒入已灭菌的液体石蜡，油层要高出斜面上端1cm，使之与空气隔绝，然后垂直放于室温或冰箱内保藏即可。
这种方法也比较简便，且保藏时间一般可长达l年以上。适于保存部分霉菌、酵母菌、放线菌，但对细菌效果较差，对某些能同化烃类的微生物则不适用。
（3）砂土管保藏法
将孢子悬浮液转移至灭过菌的砂土管中，于真空干燥器内用真空泵抽干，再转至有干燥剂的容器中，密封低温保藏。本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于细菌的芽孢、霉菌和放线菌孢子的保藏，不适于对干燥敏感的无芽孢的细菌和酵母菌。主要包括砂土制备和真空抽干两步。
（4）冷冻干燥法
此法的原理是在低温下迅速将细胞冻结以保持细胞结构的完整，然后在真空下使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异和死亡，因而能长期保存，一般为5~10年。微生物在此条件下易死亡，所以需加入一些
物质作保护剂，一般常用的是脱脂牛奶、血清等。该法存活率高，变异率低，并能广泛适用于细菌（有芽孢和无芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放线菌孢子和病毒等，因此是目前广泛采用的好方法。其缺点是手续麻烦，操作复杂，要求严格，并需有一定设备条件。
（5）超低温保藏法
由于现在超低温冰箱的使用已较普及，所以菌种的超低温保藏法在生产企业和研究机构已得到广泛应用。该方法的要点是：将要保藏的菌种置于10%甘油或二甲基亚砜保护剂中，密封于试管或安瓿管中，然后将其放入超低温冰箱中于-70℃下保藏。该法简便易行，而且保藏效果较好。
二、发酵工业微生物菌种的衰退与复壮
微生物具有生命活动能力，其世代时间一般是很短的，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此常常造成工业生产菌种的退化，并有可能使优良菌种丢失，所以，如何保持菌种优良性状的稳定是研究菌种保藏的重要课题。
（一）微生物菌种的衰退
菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。常见的菌种衰退在形态上表现为分生孢子的减少或菌落颜色的改变。在生理上常指菌种发酵能力的降低，有些菌的抗噬菌体能力下降。对诱变育种而获得的高产变异株则常表现出恢复野生型性状等。但菌种的真正退化必须与由于环境原因变化而引起菌种形态、和生理上的变异区别开来。如培养基中微量元素缺乏会导致孢子数量减少，也会引起孢子颜色的改变。此外，温度、pH、不同碳氮源都会导致菌种变化。但只要一旦恢复正常条件，这些现象就会消失。此外，杂菌污染也会造成菌种退化的假象。因此，必须正确判断是否退化，才能找出正确的解决办法。一般菌种退化是从量变到质变逐渐发生的，同时也是整个群体中产量降低及其相联系的种种特性的变化，而不是指单个细胞的改变。
引起菌种退化的原因主要有： 1、基因突变
菌种退化的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变则会引起产量下降，如果控制孢子生成的基因发生负突变则孢子性能就会下降。当然，这些负突变都是自发形成的。经常处于旺盛生长状态的细胞比休眼状态细胞发生突变的机率大得多。在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。如粘质赛氏杆菌(Serratia marcescens)H-2892菌株生产力为18g/L组氨酸，经5次传代后因回复突变型增多，产量下降至4g/L。很多抗生素生物合成、产生气生菌丝和色素等性状都部分或全部受质粒基因控
制。当菌株连续传代、菌体发生质粒脱落而出现大量光秃型菌落，则生产能力也显著下降。
2、变异菌株性状分离
变异菌株性状分离也会引起高产型状的丧失。在菌种筛选工作中经常遇到初筛摇瓶产量很高，复筛产量逐渐下降而被淘汰的现象，在霉菌中更为常见。这是一种广义的退化现象。当诱变的单菌落是由一个以上孢子或细胞形成，而其中只有一个孢子或细胞是高产时，在移接传代过程中，这个高产菌株数量减少，当然产量也就下降。即使菌落是由一个孢子或单个细胞形成，只要它是多核细胞，在诱发突变中核的变化不会都一样，随着菌种传代和核的分离也会使性状表现多样化，产量也会随之变化，即使是单核孢子发生突变时，如果双链DNA上仅一条链上某个位点发生变化，经移殖后也会出现性状分离。因此一个较稳定的变异株的获得必须经过多次分离纯化。为了得到较多纯种，有人考虑提高诱变剂量，使单核细胞DNA双链中一条链的某一点发生突变，另一条链完全失活不再复制来提高纯菌产生率。通过实验得到下表所示数据。
不同剂量紫外线处理裂殖酵母时不纯菌落百分数
剂量 （以存活率计，%） 100（对照） 80~100 60~80 20~60 1~20 12165 12060 8553 4922 9884 1 13 46 65 195 — 12 20 17 28 菌落总数 突变菌落数 纯 不纯 突变频率 （突变菌落/103） 0.08 2 27 16.7 22.6 — 43 30 21 13 不纯菌落（%） 诱变突变株的稳定性和诱变剂作用机制有关，一般认为诱发DNA碱基转换或颠换时不稳定菌株出现较多，而诱发缺失交界时不稳定菌株出现较少，因为缺失是不能回复的。
3、连续传代
连续传代也是菌种退化的直接原因。个别细胞性状改变不足以引起菌种退化，经多次传代，退化细胞在数量上占优势，于是退化性状表现逐步明朗化，最终成为一株退化菌株。以芽孢杆菌的黄嘌呤缺陷型在斜面上移殖代数对回复突变率和产量的关系为例，如下表所示。
产腺苷的黄嘌呤缺陷型菌株在接种传代过程中产量和回复子数量间的关系 实移接验 代数 1 0 每代斜面保存时间（天） 147 回复子比数 1/4.5×106 腺苷产量 （g/L） 13.5 2 3 4 5 6 2 6 7 9 133，14 47，3，9，3，71，14 47，3，9，3，13，58，14 47，3，9，3，13，8，3，47，4 1/2.4×106 1/2.2×105 1/3.5×105 1/5.3×103 14.9 10.7 13.1 8.1 7.4 12 47，3，9，3，13，8，3，4，14，6，6，31 1/1.0×103 由上表可见，虽菌种总的保存时间都是147天，但随着移植代数的增加，回复突变率也增加，腺苷产量下降。这也说明，退化并不突然明显，而是当退化细胞在繁殖速率上大于正常细胞时，每移植一代，使退化细胞的优势更为显著，从而导致退化。
4、其它因素
其它如温度、湿度、培养基成分及各种培养条件都会引起菌种的基因突变。例在保藏菌种中基因突变率就随温度降低而减少，又例在产腺苷的黄膘吟缺陷型 中，若在培养基中加入黄嘌呤、鸟嘌呤及组氨酸和苏氨酸可降低回复突变的数量。
（二）防止菌种衰退和退化菌种的复壮 1、防止菌种衰退 防止菌种衰退的方法有： （1）控制传代次数
基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。因此应该尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数控制在最低水平，以降低突变机率。一般情况下，斜面每移植一代，霉菌、放线菌、芽孢杆菌在低温下可保藏半年左右，酵母可保藏3个月左右，无芽孢细菌可保藏1个月左右。为此，生产菌种每移植一代，最好同时移植较多的斜面，以供一段时间生产之需，这样移植次数就可减少。
（2）选择合适的培养条件
培养条件对菌种衰退有一定的影响，选择一个适合原种生长的条件可以防止菌种衰退。另外，生产上应避免使用陈旧的斜面菌种。
（3）利用不同类型的细胞进行传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含有许多核，甚至是异核体，因此用菌丝接种时就会出现衰退和不纯的子代。而孢子一般是单核的，利用孢子来接种，可以达到防止衰退的目的。但是这也必须注意到微生物细胞本身的特点。对构巢曲霉来说，利用它的分生孢子传代易发生衰退而用它的子囊孢子移种则不易退化。
（4）选择合适的保藏方法
采用有效的菌种保藏方法也可以防止菌种的衰退。
由于菌种衰退的情况不同，对有些衰退原因还不甚了解，因此要切实解决具
体问题，需根据实际情况，通过实验正确地加以运用。
2、退化菌种的复壮
使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为复壮。常用的方法是对已退化菌株用一定培养条件进行单细胞分离纯化。从而限制退化菌株在数量上占优势，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得得以复壮。例如用高剂量UV或再配以低剂量NTG对退化菌株进行处理，可得到较多的纯菌落，又如选择一种对退化型菌株细胞核具有更大杀伤力的诱变剂亦可使原菌株得到复壮。但这工作量不亚于新突变株的诱变育种，另外，用遗传方法选育不易退化的稳定菌株或采用双缺、三缺菌株及减少传代次数等方法，都可防止菌种退化，保存稳定菌株。
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容