过氧化氢酶(CAT)活性测定

过氧化氢酶(CAT)活性测定

高锰酸钾滴定法

(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)

一、原理

过氧化氢酶(catalase，CAT)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

2eR(Fe2+)+H2O2－3+R(FeOH)

2e－3+R(FeOH)+H2O2R(Fe2+)2+2 H2O＋O2

因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。

在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。

5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4

二、材料、仪器设备及试剂

(一)材料

植物器官(花瓣、叶片等)

(二)仪器设备

冰箱、离心机、微量加样器 (1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管

(三)试剂

(1)10% H2SO4

(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液

(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制

成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定

(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用

0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定

(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。

三、试验步骤

(一)酶液提取

取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

(二)取50mL三角瓶4个(两个测定，另两个为对照)，测定瓶加入酶液2.5mL，对照加煮死酶液2.5mL，再加2.5mL0.1mol/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO42.5mL。

(三)用0.1mol/L高锰酸钾标准液滴定，直至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。

四、结果计算

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：

过氧化氢酶活性=[(A-B)×(VT/VS)×1.7]/(W×t) [mg/(g.min)]

式中：A为对照KMnO4滴定毫克数；B为酶反应后KMnO4滴定毫克数VT为提取酶液总量，mL；Vs为反应时所用酶液量，mL；W为样品鲜重，g；t为反应时间，min；1.7为1mL 0.1mol/L高锰酸钾，相当于1.7mg H2O2。

五、注意事项

所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。