纤维素酶活测定

山东大学实验报告 2009 年 4 月16 日

姓名 孟昊 系年级 07级生命基地 组别 同组者 宋任泰 刘志远 科目 生物化学实验 题目 纤维素酶活力测定 学号 20071401102

【实验目的】

1、 学会并掌握用3、5—二硝基水杨酸法测定酶活力方法 2、 巩固使用分光光度计

【实验材料】

1、3、5—二硝基水杨酸显色液；

2、0．5%羧甲基纤维素钠水溶液（CMC）：用0.1mol/LPH4.5醋酸-醋酸钠缓

冲溶液配置；

3、标准葡萄糖溶液（1mg/mL）。

【实验步骤】

1、标准曲线的绘制：分别吸取0.2、0.4、0.6 、0.8、1.0mL的葡萄糖于5支试管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加3.5-二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10分钟,冷却,定容至25ml.以1毫升蒸馏水代替糖作空白管,同样定容至25ml。在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微克数为横坐标，绘出标准曲线（见表一）。

2、空白管的测定：取1毫升酶液,沸水浴5分钟，冷却加3毫升0.5%CMC，

与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。

3、

样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3毫升，酶液1毫升,于

50度水浴中糖化30分钟,取出,立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活,得糖化液，冷却加入3毫升显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25毫升，混匀，550nm测OD值（见表二）。

实验结果：见表一、表二：

表一 标准曲线的测定 管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖/mL 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 显色液/mL 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水至25mL A(550) 0.000 0.135 0.294 0.456 0.605 0.727

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山东大学实验报告 2009 年 4 月16 日

姓名 孟昊 系年级 07级生命基地 组别 同组者 宋任泰 刘志远 科目 生物化学实验 题目 纤维素酶活力测定 学号 20071401102

表二 样品的测定 编号 空白 样品一 样品二 样品三 酶液/mL 1(失活) 1 1 1 CMC/mL 3 3 3 3 50℃恒温30min 显色液/mL 3 3 3 3 沸水浴中煮沸显色10min,冷却,加蒸馏水至25mL A(550nm) 0.000 0．483 0.480 0.484 图一：标准葡萄糖光吸收曲线 结果分析：拟合所得的标准曲线为：Y=7.439×10-4X-0.00243。拟合度为0.99917。由样品的A值，可得三份溶液的葡萄糖含量分别为：652.5ug，648.5ug，653.9ug。所以平均含量：651.6ug。

纤维素酶活力单位=651.6/0.01×30=2172 ug/mg×min

【思考与讨论】

1、在测定时为使各样品和空白管处理一致，应同时加入试剂，同时放入水浴中，同时取出水浴，以使反应得进行程度一致。

2、在测溶液的OD值之前，应将溶液摇匀，摇匀的方法是用保鲜膜蒙住试管口，然后来回震荡试管。

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