一种重组酿酒酵母及其应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 112553099 A(43)申请公布日 2021.03.26

(21)申请号 202011451952.7(22)申请日 2020.12.09

(71)申请人 江南大学

地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大

道1800号(72)发明人 诸葛斌　任全路　贺亚曦　陆信曜　

宗红　马腾飞　(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权

代理有限公司 23211

代理人 林娟(51)Int.Cl.

C12N 1/19(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C12P 5/00(2006.01)C12R 1/865(2006.01)

(54)发明名称

一种重组酿酒酵母及其应用(57)摘要

本发明公开了一种重组酿酒酵母及其应用，属于基因工程技术领域。本发明首先构建了一株可以产蒎烯的菌株，通过基因操作同时敲除YPL062W和BTS1之后，菌株的生物量增加明显，对蒎烯的生物合成具有积极的作用，并通过融合表达蒎烯合酶基因Pt1和ERG20ww，使单位菌体产量达到最高1.15mg/L*OD。

权利要求书1页 说明书9页序列表14页 附图3页

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权　利　要　求　书

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1.一种重组酿酒酵母，其特征在于，强化表达了tHMG1，ERG20ww和IDI基因，敲除了YPL062W和BTS1基因，并融合表达了蒎烯合酶tPt1和ERG20ww；

所述ERG20ww是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基础上，将第96位的苯丙氨酸和第127位的天冬氨酸突变得到的。

2.如权利要求1所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述ERG20ww是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基础上，将第96位的苯丙氨酸突变为色氨酸，并将第127位的天冬氨酸突变为色氨酸得到的。

3.如权利要求2所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述融合表达是将蒎烯合酶tPt1和ERG20ww通过linker融合连接后表达，所述linker序列为GSGSGSGS。

4.如权利要求1‑3任一所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述蒎烯合酶tPt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；优选的，所述tHMG1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；优选的，所述IDI的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.如权利要求1‑4任一所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，所述YPL062W的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；优选的，所述BTS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.如权利要求1‑5任一所述的一种重组酿酒酵母，其特征在于，以S.cerevisiae w303或S.cerevisiae CEN.PK2‑1C为宿主细胞。

7.一种构建权利要求1‑6任一所述的重组酿酒酵母的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)化学合成蒎烯合酶基因，并将蒎烯合酶基因连接到质粒上，得到重组质粒；(2)将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ERG20ww的基因，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的tHMG1的基因和编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的IDI的基因通过同源重组的方法整合到酿酒酵母多拷贝整合位点德尔塔位点如SEQ ID NO.14所示，同时通过同源重组的方法将酿酒酵母染色体上的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示YPL062W的基因和编码核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示BTS1的基因的敲除，得到表达宿主；

(3)将步骤(1)得到重组质粒转入步骤(2)得到的表达宿主中，构建得到重组酿酒酵母。8.一种合成蒎烯的方法，其特征在于，将权利要求1‑6任一所述的重组酿酒酵母添加至培养基中培养，得到种子液，再将种子液接种至培养基中，发酵制备蒎烯。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵是在30℃，200rpm条件下发酵10‑12h后，添加十二烷，接着摇瓶发酵70‑120h。

10.权利要求1‑6任一所述的重组酿酒酵母，或权利要求8或9所述的方法在制备含有蒎烯的产品中的应用。

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一种重组酿酒酵母及其应用

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技术领域

[0001]本发明涉及一种重组酿酒酵母及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

[0002]蒎烯是一种天然活性单萜烯，广泛用作调味剂、化学品和医药，特别是蒎烯二聚体可作为喷气燃料替代品的良好候选者，也是一种耐高温润滑剂。目前，在工业上大量获取蒎烯的方法还是利用高效精馏塔从脂松节油或粗硫酸盐松节油中进行分离提取。这类传统的获取蒎烯的方法存在着效率低、操作复杂繁琐、能源消耗大和设备技术要求高等缺点，同时破坏环境、消耗大量自然资源。因此，蒎烯的生物技术生产受到越来越多的关注。[0003]酿酒酵母在生产萜类物质具有得天独厚的优势，酵母细胞在细胞色素P450酶的功能性表达方面比原核宿主具有优势，而细胞色素P450酶是合成更复杂的单萜类化合物所必需的。有文献报道酿酒酵母在生产倍半萜和多萜时的产量要高于大肠杆菌，证明了酿酒酵母更大的生产前景。到目前为止，虽然使用细菌宿主时,单萜生物生产更有效率。然而，在细菌底盘中设计单萜生物合成的下游步骤是具有挑战性的，因为其中几个步骤需要细胞色素p450酶的功能性表达，而这在细菌中是不容易实现的。但是到目前为止,低的单蒎烯产量阻碍了酵母细胞工厂有效的p450的进一步反应，并且现有的产率过低，导致生物法生产蒎烯在工业上的应用受限，所以实现酿酒酵母更高的蒎烯产量及更高的产率具有极大的意义。发明内容

[0004]为了得到一种提高重组酿酒酵母生物量、蒎烯产量及催化效率的方法，本发明首先提供一种重组酿酒酵母，所述重组酿酒酵母强化表达了tHMG1，ERG20ww和IDI基因，敲除了YPL062W和BTS1基因，并融合表达了蒎烯合酶tPt1和ERG20ww。[0005]所述ERG20ww是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基础上，将第96位的苯丙氨酸和第127位的天冬氨酸突变得到的。[0006]在本发明的一种实施方式中，所述ERG20ww是在核氨酸序列如SEQ ID NO.1所示的ERG20的基础上，将第96位的苯丙氨酸突变为色氨酸，且将第127位的天冬氨酸突变为色氨酸得到的。

[0007]在本发明的一种实施方式中，所述融合表达为通过linker进行融合表达，所述linker序列为GSGSGSGS。

[0008]在本发明的一种实施方式中，所述蒎烯合酶tPt1来自火炬松，其为蒎烯合酶基因Pt的截短序列；所述蒎烯合酶tPt1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述蒎烯合酶tPt1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。在本发明的一种实施方式中，本发明提供的来自火炬松的蒎烯合酶基因Pt1由苏州金唯智公司合成，过表达来自火炬松的截短的tPt1，多拷贝位点整合过表达了酿酒酵母MVA通路的限制酶基因tHMG1、IDI和ERG20的突变体ERG20ww(F96W/N127W)，并通过敲除YPL062W和BTS1，以及融合表达ERG20ww和tPt1实现蒎烯的生产提高。[0009]在本发明的一种实施方式中，所述ERG20的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

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在本发明的一种实施方式中，所述ERG20ww的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0011]在本发明的一种实施方式中，所述tHMG1的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。[0012]在本发明的一种实施方式中，所述tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。[0013]在本发明的一种实施方式中，所述IDI的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。[0014]在本发明的一种实施方式中，所述IDI的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。[0015]在本发明的一种实施方式中，所述YPL062W的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。[0016]在本发明的一种实施方式中，所述YPL062W的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。[0017]在本发明的一种实施方式中，所述BTS1的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。[0018]在本发明的一种实施方式中，所述BTS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。[0019]在本发明的一种实施方式中，以p424为表达载体。[0020]在本发明的一种实施方式中，以S.cerevisiae w303、S.cerevisiae CEN.PK2‑1C为宿主细胞。

[0021]本发明还提供了一种构建上述重组酿酒酵母的方法，包括以下步骤：[0022](1)化学合成蒎烯合酶基因，并将蒎烯合酶基因连接到质粒上，得到重组质粒；[0023](2)将编码核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的ERG20ww的基因，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的tHMG1的基因和编码核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的IDI的基因通过同源重组的方法整合到酿酒酵母多拷贝整合位点德尔塔位点如SEQ ID NO.14所示，同时通过同源重组的方法将酿酒酵母染色体上的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示YPL062W的基因和编码核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示BTS1的基因的敲除，得到表达宿主；[0024](3)将步骤(1)得到重组质粒转入步骤(2)得到的表达宿主中，构建得到重组酿酒酵母。

[0025]在本发明的一种实施方式中，所述蒎烯合酶来自火炬松，其为蒎烯合酶基因Pt的截短序列；所述蒎烯合酶tPt1核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述蒎烯合酶tPt1氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0026]本发明还提供了一种合成蒎烯的方法，所述方法为，将上述重组酿酒酵母添加至培养基中培养，得到种子液，将种子液接种至培养基中，发酵制备蒎烯。[0027]在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：[0028](1)挑取转化成功的上述重组菌单菌落接种到装有10mL培养基的50mL的摇瓶中，在30℃，200rpm摇床中培养24h，得到种子液；[0029](2)将步骤(1)得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种至装有50mL培养基的250mL的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵12h后，添加十二烷，接着摇瓶发酵72h；[0030](3)测定发酵的生物量并通过气相岛津GC2014检测上层十二烷中的蒎烯浓度。[0031]在本发明的一种实施方式中，所述培养基为：SD‑ura‑leu‑his液体培养基，或SD‑ura–his液体培养基，或SD‑ura液体培养基，或MM液体培养基。[0032]本发明还提供了上述重组酿酒酵母，或上述方法在制备含有蒎烯的产品中的应用。

[0033]有益效果

[0034]本发明取得的有益效果如下：本发明表达来自火炬松的蒎烯合酶基因，并通过MVA通路的ERG20ww，tHMG1和IDI强化，YPL062W和BTS1的敲除，融合表达在S.cerevisiae 

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CEN.PK2‑1C中实现更高的蒎烯生产及最高的单位菌体产量。其中YPL062W和BTS1的双敲除在YPD培养基中表现出很高的生物量生长，但是在蒎烯发酵过程中蒎烯最终的产量只增加了15％，在加入融合表达的蒎烯合酶表达质粒后，产量具有一个明显的提高，增加到7.09mg/L，单位菌体产量为1.15mg/L*OD。相对于仅仅敲除YPL062W和BTS1产率提高了11倍；相对于仅仅融合表达的2.2倍。

附图说明

[0035]图1：发酵十二烷层气相分析结果显示蒎烯出峰时间。[0036]图2：发酵样品气相质谱分析检测蒎烯检测谱图。[0037]图3：蒎烯标准品气相质谱分析检测谱图。[0038]图4：ERG20ww，tHMG1和IDI整合到基因组的表达元件的构建。[0039]图5：YPL062W和BTS1的敲除元件的构建。[0040]图6：YPL062w和BTS1单敲除和双敲除在YPD培养基中的生长情况。[0041]图7：蒎烯合成工程菌株的发酵生产蒎烯的结果图。

具体实施方式

[0042]下述实施例中所涉及的S.cerevisiae  CEN.PK2‑1C公开于论文：Identificationand characterization from Candida glycerinogenes of hexose transporters having high efficiency at high glucose concentrations中。[0043]下述实施例中所涉及的培养基如下：[0044]YPD培养基：酵母膏10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。[0045]SD‑ura‑leu‑his固体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L，ura20mg/L,leu60mg/L,his20mg/L,琼脂20g/L。

[0046]SD‑ura‑leu‑his液体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L，ura20mg/L,leu60mg/L,his20mg/L。

[0047]SD‑ura‑his固体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L，ura20mg/L,his20mg/L,琼脂20g/L。

[0048]SD‑ura固体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L，ura20mg/L，琼脂20g/L。[0049]MM固体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。[0050]SD‑ura–his液体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L，ura20mg/L，his20mg/L。[0051]SD‑ura液体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L，ura20mg/L。[0052]MM液体培养基：YNB：6.7g/L，葡萄糖20g/L。[0053]下述实施例中所涉及的检测方法如下：[0054]蒎烯含量的检测方法：

[0055]取上层十二烷层加入无水硫酸钠除水4‑5h，过有机膜后进行气相质谱分析。气相分析条件：色谱条件为HP‑5ms毛细管色谱柱(Agilent公司)，进样量1μL；柱温起始温度70℃，保持3min；然后以5℃·min‑1升至100℃，保持3min；最后以40℃·min‑1升至250℃，保持5min；进样口温度与色谱‑质谱接口温度均为260℃。

[0056]下述实施例中所涉及的引物序列如表1和表2所示：

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表1引物

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表2引物

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实施例1：来自火炬松的蒎烯合酶在S.cerevisiae CEN.PK2‑1C中表达

[0064]具体步骤如下：[0065](1)化学合成编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示蒎烯合酶基因tPt1；[0066](2)将蒎烯合酶基因tPt1通过BamHⅠ酶酶切连接到p424‑TEF1质粒上构建p424‑tPt1重组质粒，其中p424的构建方法：p424的质粒是由p414质粒更换了复制序列CEN/ARS为2μ而来，p414质粒是由Dominik Mumberg等人在商业质粒pRS416的基础上添加TEF1启动子构建而来(Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds)。

[0067]将重组质粒利用醋酸锂转化法转化到S.cerevisiae CEN.PK2‑1C，并涂布于SD‑ura‑leu‑his固体培养基进行筛选，挑取单菌落进行验证，挑取验证阳性转化子转接含有SD‑ura‑leu‑his液体培养基的50mL摇瓶培养，甘油管保存菌株。[0068](3)将步骤(2)得到的菌株接种至10mL种子培养基的50mL的摇瓶中，在30℃，200rpm摇床中培养24h，得到种子液；将得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种至装有50mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵12h后，添加十二烷，接着摇瓶发酵120h，通过气相岛津GC2014检测上层十二烷中的蒎烯浓度。并通过质谱分析确定蒎烯的成功合成，气相质谱确定蒎烯合酶在酿酒酵母菌中表达，合成了蒎烯，如图2‑3所示。[0069]实施例2：重组质粒的构建：

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具体步骤如下：

[0071]1、p424‑ERG20ww‑(GS)*4‑tPt1的构建方法：[0072]在构建的p424‑tPt1的基础上，先用BamHⅠ单切p424‑tPt1，通过设计引物(ERG20ww‑(GS)4‑tPt1‑F，ERG20ww‑(GS)4‑tPt1‑R)克隆ERG20ww，将GS*4的Linker连接到ERG20ww和tPt1中间，用同源重组酶连接到用BamHⅠ单切好的p424‑tPt1质粒上，转化大肠杆菌感受态JM109，生长过夜后，挑取生长菌株做菌落PCR，验证正确的菌株提取质粒做进一步酶切验证并测序，确定p424‑ERG20ww‑(GS)*4‑tPt1构建成功。[0073]2、p424‑tPt1‑(GS)*4‑ERG20ww的构建方法：[0074]在构建的p424‑tPt1的基础上，先用NotⅠ单切p424‑tPt1，通过设计引物(tPt1‑(GS)4‑ERG20ww‑F，tPt1‑(GS)4‑ERG20ww‑R)克隆ERG20ww，将GS*4的Linker连接到tPt1和ERG20ww中间，用同源重组酶连接到用NotⅠ单切好的p424‑tPt1质粒上，转化大肠杆菌感受态JM109，生长过夜后，挑取生长菌株做菌落PCR，验证正确的菌株提取质粒做进一步酶切验证并测序，确定p424‑tPt1‑(GS)*4‑ERG20ww构建成功。[0075]3、p424‑tPt1的构建方法：[0076]设计引物(p414‑tPt1‑F，p414‑Pt1‑R)从合成的质粒pUC57‑Pt1上克隆下tPt1，用同源重组酶连接到用BamHⅠ单切的p424质粒上，转化大肠杆菌感受态JM109，生长过夜后，挑取生长菌株做菌落PCR，验证正确的菌株提取质粒做进一步酶切验证并测序，确定p424‑tPt1构建成功。[0077]实施例3：宿主细胞的构建：[0078]将S.cerevisiae CEN.PK2‑1C在YPD培养基中培养至稳定期，按照参考文献《酵母遗传学技术手册》进行提取基因组，然后设计tHMG1引物(tHMG–F，tHMG–R)从基因组上PCR扩增下来，进行1％琼脂糖凝胶电泳验证，纯化后连接到BamHⅠ单切的p424质粒上。构建成功p424‑tHMG1。设计引物(pGAP‑F，pGAP‑R；IDI‑F，IDI‑R)从基因组上克隆出pGAP和IDI，利用融合PCR连接pGAP‑IDI；纯化后连接到KpnⅠ的单切的p424‑tHMG1上，构建成功p424‑TEF1‑tHMG1‑tCYC1‑pGAP‑IDI；接着设计引物(德尔塔1‑F，德尔塔1‑R；p424‑t‑i‑F，p424‑t‑i‑R；tI‑leu‑F，tI‑leu‑R；德尔塔2‑F，德尔塔2‑R)其中LEU来自于商业质粒p181质粒，从基因组上克隆下德尔塔同源臂，同源序列如SEQ ID NO.14所示，克隆下TEF1‑tHMG1‑tCYC1‑pGAP‑IDI表达原件和LEU筛选标记，利用醋酸锂转化法将纯化后的片段转化S.cerevisiae CEN.PK2‑1C菌株，涂布SD‑ura‑trp‑his固体培养基，生长3天后筛选验证构建成功CEN，tI菌株，整合元件如图4所示。

[0079]在以上构建的菌株的基础上构建过表达ERG20ww和另一个拷贝的IDI的菌株，设计引物(NTS1‑2a‑F，NTS1‑2a‑R；pTDH3‑F，pTDH3‑R；ERG20ww‑F，ERG20ww‑R；tADH‑F，tADH‑R；pPGK1‑F，pPGK1‑R；IDI‑F，IDI‑R；tPGK‑F，tPGK‑R；HIS‑F，HIS‑R；NTS1‑2b‑F，NTS1‑2b‑R)从基因组上克隆出同源片段，pTDH3，tADH，pPGK1，IDI，tPGK，以及突变好的ERG20ww，HIS来自于商业质粒pY13，采用同源序列如SEQ ID NO.15所示；进行1％琼脂糖凝胶电泳验证；利用醋酸锂转化法将纯化后的片段转化CEN，tI菌株，涂布SD‑ura‑trp固体培养基，生长3天后筛选验证构建成功CEN，tI，Ew‑I菌株，。[0080]通过对S.cerevisiae CEN.PK2‑1C基因组分析查找，找到YPL062W和BTS1基因的上下游同源臂各500bp如表2所示，设计引物(YPL‑UP‑F，YPL‑UP‑R；KanMX‑F，KanMX‑R；YPL‑

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DOWN‑F，YPL‑DOWN‑R；BTS1‑UP‑F，BTS1‑UP‑R；LOXP‑URA3‑F，LOXP‑URA3‑R；BTS1‑DOWN‑F，BTS1‑DOWN‑RPCR)从基因组克隆获得，KanMX和URA3的分别来自于质粒pUG6和pYX212。进行1％琼脂糖凝胶电泳验证。利用醋酸锂转化法将纯化后的片段转化CEN，tI菌株；CEN，tI，Ew‑I菌株，分别涂布YPD培养基添加200mg/L的G418固体培养基，SD‑trp‑his固体培养基，SD‑trp固体培养基，生长3天后筛选验证构建成功，CEN.tI,ΔBTS1菌株；CEN.Δypl，tI菌株；CEN.Δypl，tI,ΔBTS1菌株；Δypl，ΔBTS1，tI,Ew‑I菌株敲除元件如图5所示，菌株的生长状况如图6所示。[0081]实施例4：重组菌SCPS的构建

[0082]将实施例2中构建好的质粒p424‑tPt1利用醋酸锂转化法转化到实施例3中构建的宿主菌CEN，tI菌株；CEN，tI，Ew‑I菌株；Δypl，ΔBTS1，tI,Ew‑I菌株分别涂布SD‑ura–his、SD‑ura、MM固体培养基生长3天，筛选验证构建成重组菌SCPS‑1、SCPS‑2、SCPS‑3。

[0083]将实施例2中构建好的质粒p424‑ERG20ww‑(GS)*4‑tPt1和p424‑tPt1‑(GS)*4‑ERG20ww利用醋酸锂转化法转化到实施例3中构建的宿主菌CEN，tI，Ew‑I涂布SD‑ura固体培养基生长3天，筛选验证构建成重组菌SCPS‑4、SCPS‑5。

[0084]将实施例2中构建好的质粒p424‑ERG20ww‑(GS)*4‑tPt1利用醋酸锂转化法转化到实施例3中构建的宿主菌Δypl，ΔBTS1，tI,Ew‑I涂布MM固体培养基生长3天，筛选验证构建成重组菌SCPS‑6。[0085]实施例5：发酵生产蒎烯[0086]具体步骤如下：

[0087]将实施例4得到的菌株SCPS‑1～SCPS‑6接种至10mL种子培养基的50mL的摇瓶中，在30℃，200rpm摇床中培养24h，得到种子液；将得到的种子液以1％(v/v)的接种量，接种至装有50mL发酵培养基的250mL的摇瓶中，在30℃，200rpm条件下发酵12h后，添加十二烷，接着摇瓶发酵120h，测定发酵过程生物量的变化(如表3所示)，发酵结束后，取上层十二烷层1mL10000r/min离心10分钟，加入无水硫酸钠除水4h，然后通过气相岛津GC2014检测上层十二烷中的蒎烯出峰时间如图1所示，测定蒎烯产量如表4、如图7所示；通过菌株的产量与生物量的比值计算产率，结果如表5所示。[0088]表3菌株生物量

[0089]

[0090][0091]

菌株SCPS‑1SCPS‑2SCPS‑3SCPS‑4SCPS‑5SCPS‑6

表4蒎烯的产量菌株SCPS‑1SCPS‑2SCPS‑3

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生物量(OD600)7.126.326.575.826.386.16产量(mg/L)0.2830.5070.583

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0.832.187.088

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[0092][0093]

SCPS‑4SCPS‑5SCPS‑6

表5蒎烯的产率

菌株产率(mg/L*OD)SCPS‑10.04SCPS‑20.08SCPS‑30.09SCPS‑40.14SCPS‑50.34SCPS‑61.15

[0094]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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序　列　表

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SEQUENCE LISTING<110> 江南大学<120> 一种重组酿酒酵母及其应用<130> BAA201034A<160> 15<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 352<212> PRT<213> 人工序列<400> 1Met Ala Ser Glu Lys Glu Ile Arg Arg Glu Arg Phe Leu Asn Val Phe

  10  151  5

Pro Lys Leu Val Glu Glu Leu Asn Ala Ser Leu Leu Ala Tyr Gly Met 20  25  30Pro Lys Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Ala His Ser Leu Asn Tyr Asn Thr 35  40  45Pro Gly Gly Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Thr Tyr Ala 50  55  60Ile Leu Ser Asn Lys Thr Val Glu Gln Leu Gly Gln Glu Glu Tyr Glu65  70  75  80Lys Val Ala Ile Leu Gly Trp Cys Ile Glu Leu Leu Gln Ala Tyr Phe 85  90  95Leu Val Ala Asp Asp Met Met Asp Lys Ser Ile Thr Arg Arg Gly Gln 100  105  110Pro Cys Trp Tyr Lys Val Pro Glu Val Gly Glu Ile Ala Ile Asn Asp 115  120  125Ala Phe Met Leu Glu Ala Ala Ile Tyr Lys Leu Leu Lys Ser His Phe 130  135  140Arg Asn Glu Lys Tyr Tyr Ile Asp Ile Thr Glu Leu Phe His Glu Val145  150  155  160Thr Phe Gln Thr Glu Leu Gly Gln Leu Met Asp Leu Ile Thr Ala Pro 165  170  175Glu Asp Lys Val Asp Leu Ser Lys Phe Ser Leu Lys Lys His Ser Phe 180  185  190Ile Val Thr Phe Lys Thr Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala 195  200  205Leu Ala Met Tyr Val Ala Gly Ile Thr Asp Glu Lys Asp Leu Lys Gln

12

CN 112553099 A

序　列　表

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210  215  220Ala Arg Asp Val Leu Ile Pro Leu Gly Glu Tyr Phe Gln Ile Gln Asp225  230  235  240Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly Thr Pro Glu Gln Ile Gly Lys Ile Gly 245  250  255Thr Asp Ile Gln Asp Asn Lys Cys Ser Trp Val Ile Asn Lys Ala Leu 260  265  270Glu Leu Ala Ser Ala Glu Gln Arg Lys Thr Leu Asp Glu Asn Tyr Gly 275  280  285Lys Lys Asp Ser Val Ala Glu Ala Lys Cys Lys Lys Ile Phe Asn Asp

  295  300 290

Leu Lys Ile Asp Gln Leu Tyr His Glu Tyr Glu Glu Ser Val Ala Lys  310  315  320305Asp Leu Lys Ala Lys Ile Ser Gln Val Asp Glu Ser Arg Gly Phe Lys 325  330  335Ala Asp Val Leu Thr Ala Phe Leu Asn Lys Val Tyr Lys Arg Ser Lys 340  345  350<210> 2<211> 1749<212> DNA<213> 人工序列<400> 2atggcttcta tgagtatgaa cttgaggacc gctgtctctg atgacgctgt catcagaagg 60aggggtgact tccacagtaa cttgtgggac gatgatttga ttcagtcttt gtcttctcct 120tacggtgagc catcttatag ggagagagcc gagaggctta ttggtgaggt taaaaattct 180tttaatagta tgagtaacga ggatggtgag agtatcaccc ctttggacga cttgatccaa 240aggttgtgga tggtcgacag tgtcgaaagg cttggaatcg atagacactt caaaaaggag 300attaagagtg cccttgacca cgtctataga tactggtctg agaagggaat cggttgcggt 360agagagtctg tcgtcactga ccttaattct accgccttgg gattgaggac cttgaggctt 420cacggttacg acgtcagtgc tgacgttttg aaccacttca aaaaccagag tggtcagttc 480gcttgtaccc ttaagcagac cgaggaccag attagaaccg ttttgaactt gtatagagcc 540tctcttatcg ccttccccgg tgagaaggtt atggacgagg ctgagtcttt cagtgctaaa 600tatttgaagg aagccttgca gaagatccca gtctcttctt tctctaggga gatcggtgac 660gtcttggaat acggatggca tacctacttg cctaggttgg aggctagaaa ctacatcgac 720gtcttcggtc aagataccga gaacagtaaa tcttatatga aaaccgaaaa acttttggaa 780ttggctaagt tggagttcaa catcttccac gctttgcaaa agagggagct tgagtacttg 840gtcagatggt ggaagggaag tggtagtcct cagatgacct tttgtaggca tagacatgtc 900gagtactaca cccttgccag ttgtatcgcc ttcgagcctc agcacagtgg attcagactt 960ggattcgcca aggcttgtca catcattact gtccttgatg acatgtatga tacctttgga 1020

13

CN 112553099 A

序　列　表

3/14页

accttggacg agttggagct tttcaccagt gccatcaaga gatgggaccc aagtgccacc 1080gaatgcttgc cagagtacat gaaaggtgtt tatatgattg tttacaatac cgtcaacgag 1140atgtctcaag aggctgacaa ggcccaaggt agggacacct tgaactactg tagacaagca 1200tgggaagagt atatcgacgc ctacatgcaa gaagccaagt ggattgcttc tggagaggtc 1260ccaacctttg aggagtacta cgagaacgga aaggtctctt ctggacatag agttagtgct 1320ttgcagccaa tcttgaccac cgacatccct ttcccagagc acgtcttgaa agaagttgac 1380attccatctc agcttaacga tttggcctct gccatcttga ggcttagggg tgatactaga 1440tgctaccaag ccgacagagc taggggagag gaggccagtt gcatctcttg ctacatgaag 1500gacaaccccg gaaccactga ggaagacgct cttaaccacc ttaacgccat gatttctgac 1560gttattaaag gtcttaactg ggagttgttg aagccaaact ctagtgttcc aatctctgct 1620

 ccttcgacat ttctagggcc ttccactgcg gttacaagta tagggatgga 1680aagaagcacg

tacagtgttg ctaatattga aaccaagtct ttggtcaaaa gaaccgttat tgatccagtt 1740

 1749actctttaa

<210> 3<211> 582<212> PRT<213> 人工序列<400> 3Met Ala Ser Met Ser Met Asn Leu Arg Thr Ala Val Ser Asp Asp Ala1  5  10  15Val Ile Arg Arg Arg Gly Asp Phe His Ser Asn Leu Trp Asp Asp Asp 20  25  30Leu Ile Gln Ser Leu Ser Ser Pro Tyr Gly Glu Pro Ser Tyr Arg Glu 35  40  45Arg Ala Glu Arg Leu Ile Gly Glu Val Lys Asn Ser Phe Asn Ser Met 50  55  60Ser Asn Glu Asp Gly Glu Ser Ile Thr Pro Leu Asp Asp Leu Ile Gln65  70  75  80Arg Leu Trp Met Val Asp Ser Val Glu Arg Leu Gly Ile Asp Arg His 85  90  95Phe Lys Lys Glu Ile Lys Ser Ala Leu Asp His Val Tyr Arg Tyr Trp 100  105  110Ser Glu Lys Gly Ile Gly Cys Gly Arg Glu Ser Val Val Thr Asp Leu 115  120  125Asn Ser Thr Ala Leu Gly Leu Arg Thr Leu Arg Leu His Gly Tyr Asp 130  135  140Val Ser Ala Asp Val Leu Asn His Phe Lys Asn Gln Ser Gly Gln Phe145  150  155  160Ala Cys Thr Leu Lys Gln Thr Glu Asp Gln Ile Arg Thr Val Leu Asn

14

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序　列　表

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165  170  175Leu Tyr Arg Ala Ser Leu Ile Ala Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Asp 180  185  190Glu Ala Glu Ser Phe Ser Ala Lys Tyr Leu Lys Glu Ala Leu Gln Lys 195  200  205Ile Pro Val Ser Ser Phe Ser Arg Glu Ile Gly Asp Val Leu Glu Tyr 210  215  220Gly Trp His Thr Tyr Leu Pro Arg Leu Glu Ala Arg Asn Tyr Ile Asp225  230  235  240Val Phe Gly Gln Asp Thr Glu Asn Ser Lys Ser Tyr Met Lys Thr Glu

  250  255 245

Lys Leu Leu Glu Leu Ala Lys Leu Glu Phe Asn Ile Phe His Ala Leu

  265  270 260

Gln Lys Arg Glu Leu Glu Tyr Leu Val Arg Trp Trp Lys Gly Ser Gly 275  280  285Ser Pro Gln Met Thr Phe Cys Arg His Arg His Val Glu Tyr Tyr Thr 290  295  300Leu Ala Ser Cys Ile Ala Phe Glu Pro Gln His Ser Gly Phe Arg Leu305  310  315  320Gly Phe Ala Lys Ala Cys His Ile Ile Thr Val Leu Asp Asp Met Tyr 325  330  335Asp Thr Phe Gly Thr Leu Asp Glu Leu Glu Leu Phe Thr Ser Ala Ile 340  345  350Lys Arg Trp Asp Pro Ser Ala Thr Glu Cys Leu Pro Glu Tyr Met Lys 355  360  365Gly Val Tyr Met Ile Val Tyr Asn Thr Val Asn Glu Met Ser Gln Glu 370  375  380Ala Asp Lys Ala Gln Gly Arg Asp Thr Leu Asn Tyr Cys Arg Gln Ala385  390  395  400Trp Glu Glu Tyr Ile Asp Ala Tyr Met Gln Glu Ala Lys Trp Ile Ala 405  410  415Ser Gly Glu Val Pro Thr Phe Glu Glu Tyr Tyr Glu Asn Gly Lys Val 420  425  430Ser Ser Gly His Arg Val Ser Ala Leu Gln Pro Ile Leu Thr Thr Asp 435  440  445Ile Pro Phe Pro Glu His Val Leu Lys Glu Val Asp Ile Pro Ser Gln 450  455  460Leu Asn Asp Leu Ala Ser Ala Ile Leu Arg Leu Arg Gly Asp Thr Arg465  470  475  480

15

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序　列　表

5/14页

Cys Tyr Gln Ala Asp Arg Ala Arg Gly Glu Glu Ala Ser Cys Ile Ser 485  490  495Cys Tyr Met Lys Asp Asn Pro Gly Thr Thr Glu Glu Asp Ala Leu Asn 500  505  510His Leu Asn Ala Met Ile Ser Asp Val Ile Lys Gly Leu Asn Trp Glu 515  520  525Leu Leu Lys Pro Asn Ser Ser Val Pro Ile Ser Ala Lys Lys His Ala 530  535  540Phe Asp Ile Ser Arg Ala Phe His Cys Gly Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly545  550  555  560

 Glu Thr Lys Ser Leu Val Lys Arg Thr ValTyr Ser Val Ala Asn Ile

565  570  575

 Asp Pro Val Thr LeuIle

580<210> 4<211> 1059<212> DNA<213> 人工序列<400> 4atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagttaa atagaggttt gtccgttgtg 180gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240aaggttgcta ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttactggtt ggtcgccgat 300gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360gttggggaaa ttgccatctg ggacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaagtc 480accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600tattctttct acttgcctgt cgcattggct atgtacgttg ccggtatcac agatgaaaag 660gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatatttcca aattcaagat 720gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattagaac ttgcttccgc agaacaaaga 840aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900attttcaatg acttgaaaat cgaccagtta taccacgaat atgaagagtc tgttgccaag 960gatttgaagg ccaagatctc ccaagtcgac gagtctcgtg gcttcaaagc cgacgtctta 1020actgcgtttt tgaacaaggt ttacaagaga agtaaataa 1059<210> 5<211> 1008

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序　列　表

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<212> DNA<213> 人工序列<400> 5atggaggcca agatagatga gctgatcaat aatgatcctg tttggtccag ccaaaatgaa 60agcttgattt caaaacctta taatcacatc cttttgaaac ctggcaagaa ctttagacta 120aatttaatag ttcaaattaa cagagttatg aatttgccca aagaccagct ggccatagtt 180tcgcaaattg ttgagctctt gcataattcc agccttttaa tcgacgatat agaagataat 240gctcccttga gaaggggaca gaccacttct cacttaatct tcggtgtacc ctccactata 300aacaccgcaa attatatgta tttcagagcc atgcaacttg tatcgcagct aaccacaaaa 360gagcctttgt atcataattt gattacgatt ttcaacgaag aattgatcaa tctacatagg 420

 tggatatata ctggagagac tttctgcctg aaatcatacc tactcaggag 480ggacaaggct

atgtatttga atatggttat gaataaaaca ggcggccttt tcagattaac gttgagactc 540

 tgtctccttc ctcacaccac ggccattcgt tggttccttt cataaatctt 600atggaagcgc

ctgggtatta tttatcagat tagagatgat tacttgaatt tgaaagattt ccaaatgtcc 660agcgaaaaag gctttgctga ggacattaca gaggggaagt tatcttttcc catcgtccac 720gcccttaact tcactaaaac gaaaggtcaa actgagcaac acaatgaaat tctaagaatt 780ctcctgttga ggacaagtga taaagatata aaactaaagc tgattcaaat actggaattc 840gacaccaatt cattggccta caccaaaaat tttattaatc aattagtgaa tatgataaaa 900aatgataatg aaaataagta tttacctgat ttggcttcgc attccgacac cgccaccaat 960ttacatgacg aattgttata tataatagac cacttatccg aattgtga 1008<210> 6<211> 335<212> PRT<213> 人工序列<400> 6Met Glu Ala Lys Ile Asp Glu Leu Ile Asn Asn Asp Pro Val Trp Ser1  5  10  15Ser Gln Asn Glu Ser Leu Ile Ser Lys Pro Tyr Asn His Ile Leu Leu 20  25  30Lys Pro Gly Lys Asn Phe Arg Leu Asn Leu Ile Val Gln Ile Asn Arg 35  40  45Val Met Asn Leu Pro Lys Asp Gln Leu Ala Ile Val Ser Gln Ile Val 50  55  60Glu Leu Leu His Asn Ser Ser Leu Leu Ile Asp Asp Ile Glu Asp Asn65  70  75  80Ala Pro Leu Arg Arg Gly Gln Thr Thr Ser His Leu Ile Phe Gly Val 85  90  95Pro Ser Thr Ile Asn Thr Ala Asn Tyr Met Tyr Phe Arg Ala Met Gln 100  105  110

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序　列　表

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Leu Val Ser Gln Leu Thr Thr Lys Glu Pro Leu Tyr His Asn Leu Ile 115  120  125Thr Ile Phe Asn Glu Glu Leu Ile Asn Leu His Arg Gly Gln Gly Leu 130  135  140Asp Ile Tyr Trp Arg Asp Phe Leu Pro Glu Ile Ile Pro Thr Gln Glu145  150  155  160Met Tyr Leu Asn Met Val Met Asn Lys Thr Gly Gly Leu Phe Arg Leu 165  170  175Thr Leu Arg Leu Met Glu Ala Leu Ser Pro Ser Ser His His Gly His 180  185  190

 Asn Leu Leu Gly Ile Ile Tyr Gln Ile ArgSer Leu Val Pro Phe Ile

195  200  205

 Met Ser Ser Glu Lys GlyAsp Asp Tyr Leu Asn Leu Lys Asp Phe Gln

210  215  220Phe Ala Glu Asp Ile Thr Glu Gly Lys Leu Ser Phe Pro Ile Val His225  230  235  240Ala Leu Asn Phe Thr Lys Thr Lys Gly Gln Thr Glu Gln His Asn Glu 245  250  255Ile Leu Arg Ile Leu Leu Leu Arg Thr Ser Asp Lys Asp Ile Lys Leu 260  265  270Lys Leu Ile Gln Ile Leu Glu Phe Asp Thr Asn Ser Leu Ala Tyr Thr 275  280  285Lys Asn Phe Ile Asn Gln Leu Val Asn Met Ile Lys Asn Asp Asn Glu 290  295  300Asn Lys Tyr Leu Pro Asp Leu Ala Ser His Ser Asp Thr Ala Thr Asn305  310  315  320Leu His Asp Glu Leu Leu Tyr Ile Ile Asp His Leu Ser Glu Leu 325  330  335<210> 7<211> 1059<212> DNA<213> 人工序列<400> 7atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagttaa atagaggttt gtccgttgtg 180gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240aaggttgcta ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

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序　列　表

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gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaagtc 480accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600tattctttct acttgcctgt cgcattggct atgtacgttg ccggtatcac agatgaaaag 660gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatatttcca aattcaagat 720gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattagaac ttgcttccgc agaacaaaga 840aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900attttcaatg acttgaaaat cgaccagtta taccacgaat atgaagagtc tgttgccaag 960

 ccaagatctc ccaagtcgac gagtctcgtg gcttcaaagc cgacgtctta 1020gatttgaagg

actgcgtttt tgaacaaggt ttacaagaga agtaaataa 1059<210> 8<211> 525<212> PRT<213> 人工序列<400> 8Met Asp Gln Leu Val Lys Thr Glu Val Thr Lys Lys Ser Phe Thr Ala1  5  10  15Pro Val Gln Lys Ala Ser Thr Pro Val Leu Thr Asn Lys Thr Val Ile 20  25  30Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser Ser 35  40  45Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu Ser 50  55  60Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu Ser65  70  75  80Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu Val 85  90  95Ile His Gly Lys Leu Pro Leu Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly Asp 100  105  110Thr Thr Arg Ala Val Ala Val Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Ala 115  120  125Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr Asp 130  135  140Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr Met145  150  155  160Pro Leu Pro Val Gly Val Ile Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr Ser 165  170  175

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序　列　表

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Tyr His Ile Pro Met Ala Thr Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Ala 180  185  190Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Val 195  200  205Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro Thr 210  215  220Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys Lys Ile Trp Leu Asp Ser Glu Glu Gly225  230  235  240Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala Arg 245  250  255

 His Ile Gln Thr Cys Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met ArgLeu Gln

260  265  270

 Thr Thr Thr Gly Asp Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser LysPhe Arg

275  280  285Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp Glu 290  295  300Asp Met Glu Val Val Ser Val Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys Lys305  310  315  320Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Ala 325  330  335Glu Ala Thr Ile Pro Gly Asp Val Val Arg Lys Val Leu Lys Ser Asp 340  345  350Val Ser Ala Leu Val Glu Leu Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val Gly Ser 355  360  365Ala Met Ala Gly Ser Val Gly Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn Leu 370  375  380Val Thr Ala Val Phe Leu Ala Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val385  390  395  400Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp Leu 405  410  415Arg Ile Ser Val Ser Met Pro Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly Gly 420  425  430Gly Thr Val Leu Glu Pro Gln Gly Ala Met Leu Asp Leu Leu Gly Val 435  440  445Arg Gly Pro His Ala Thr Ala Pro Gly Thr Asn Ala Arg Gln Leu Ala 450  455  460Arg Ile Val Ala Cys Ala Val Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys Ala465  470  475  480Ala Leu Ala Ala Gly His Leu Val Gln Ser His Met Thr His Asn Arg

20

CN 112553099 A

序　列　表

10/14页

485  490  495Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys Pro Asn Asn Leu Asp Ala Thr Asp Ile 500  505  510Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser Val Thr Cys Ile Lys Ser 515  520  525<210> 9<211> 1578<212> DNA<213> 人工序列<400> 9

 tggtgaaaac tgaagtcacc aagaagtctt ttactgctcc tgtacaaaag 60atggaccaat

gcttctacac cagttttaac caataaaaca gtcatttctg gatcgaaagt caaaagttta 120

 atcaggacct tcatcatcta gtgaggaaga tgattcccgc 180tcatctgcgc aatcgagctc

gatattgaaa gcttggataa gaaaatacgt cctttagaag aattagaagc attattaagt 240agtggaaata caaaacaatt gaagaacaaa gaggtcgctg ccttggttat tcacggtaag 300ttacctttgt acgctttgga gaaaaaatta ggtgatacta cgagagcggt tgcggtacgt 360aggaaggctc tttcaatttt ggcagaagct cctgtattag catctgatcg tttaccatat 420aaaaattatg actacgaccg cgtatttggc gcttgttgtg aaaatgttat aggttacatg 480cctttgcccg ttggtgttat aggccccttg gttatcgatg gtacatctta tcatatacca 540atggcaacta cagagggttg tttggtagct tctgccatgc gtggctgtaa ggcaatcaat 600gctggcggtg gtgcaacaac tgttttaact aaggatggta tgacaagagg cccagtagtc 660cgtttcccaa ctttgaaaag atctggtgcc tgtaagatat ggttagactc agaagaggga 720caaaacgcaa ttaaaaaagc ttttaactct acatcaagat ttgcacgtct gcaacatatt 780caaacttgtc tagcaggaga tttactcttc atgagattta gaacaactac tggtgacgca 840atgggtatga atatgatttc taaaggtgtc gaatactcat taaagcaaat ggtagaagag 900tatggctggg aagatatgga ggttgtctcc gtttctggta actactgtac cgacaaaaaa 960ccagctgcca tcaactggat cgaaggtcgt ggtaagagtg tcgtcgcaga agctactatt 1020cctggtgatg ttgtcagaaa agtgttaaaa agtgatgttt ccgcattggt tgagttgaac 1080attgctaaga atttggttgg atctgcaatg gctgggtctg ttggtggatt taacgcacat 1140gcagctaatt tagtgacagc tgttttcttg gcattaggac aagatcctgc acaaaatgtt 1200gaaagttcca actgtataac attgatgaaa gaagtggacg gtgatttgag aatttccgta 1260tccatgccat ccatcgaagt aggtaccatc ggtggtggta ctgttctaga accacaaggt 1320gccatgttgg acttattagg tgtaagaggc ccgcatgcta ccgctcctgg taccaacgca 1380cgtcaattag caagaatagt tgcctgtgcc gtcttggcag gtgaattatc cttatgtgct 1440gccctagcag ccggccattt ggttcaaagt catatgaccc acaacaggaa acctgctgaa 1500ccaacaaaac ctaacaattt ggacgccact gatataaatc gtttgaaaga tgggtccgtc 1560acctgcatta aatcctaa 1578<210> 10<211> 288

21

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序　列　表

11/14页

<212> PRT<213> 人工序列<400> 10Met Thr Ala Asp Asn Asn Ser Met Pro His Gly Ala Val Ser Ser Tyr1  5  10  15Ala Lys Leu Val Gln Asn Gln Thr Pro Glu Asp Ile Leu Glu Glu Phe 20  25  30Pro Glu Ile Ile Pro Leu Gln Gln Arg Pro Asn Thr Arg Ser Ser Glu 35  40  45Thr Ser Asn Asp Glu Ser Gly Glu Thr Cys Phe Ser Gly His Asp Glu 50  55  60Glu Gln Ile Lys Leu Met Asn Glu Asn Cys Ile Val Leu Asp Trp Asp  70  75  8065Asp Asn Ala Ile Gly Ala Gly Thr Lys Lys Val Cys His Leu Met Glu 85  90  95Asn Ile Glu Lys Gly Leu Leu His Arg Ala Phe Ser Val Phe Ile Phe 100  105  110Asn Glu Gln Gly Glu Leu Leu Leu Gln Gln Arg Ala Thr Glu Lys Ile 115  120  125Thr Phe Pro Asp Leu Trp Thr Asn Thr Cys Cys Ser His Pro Leu Cys 130  135  140Ile Asp Asp Glu Leu Gly Leu Lys Gly Lys Leu Asp Asp Lys Ile Lys145  150  155  160Gly Ala Ile Thr Ala Ala Val Arg Lys Leu Asp His Glu Leu Gly Ile 165  170  175Pro Glu Asp Glu Thr Lys Thr Arg Gly Lys Phe His Phe Leu Asn Arg 180  185  190Ile His Tyr Met Ala Pro Ser Asn Glu Pro Trp Gly Glu His Glu Ile 195  200  205Asp Tyr Ile Leu Phe Tyr Lys Ile Asn Ala Lys Glu Asn Leu Thr Val 210  215  220Asn Pro Asn Val Asn Glu Val Arg Asp Phe Lys Trp Val Ser Pro Asn225  230  235  240Asp Leu Lys Thr Met Phe Ala Asp Pro Ser Tyr Lys Phe Thr Pro Trp 245  250  255Phe Lys Ile Ile Cys Glu Asn Tyr Leu Phe Asn Trp Trp Glu Gln Leu 260  265  270Asp Asp Leu Ser Glu Val Glu Asn Asp Arg Gln Ile His Arg Met Leu 275  280  285

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序　列　表

12/14页

<210> 11<211> 867<212> DNA<213> 人工序列<400> 11atgactgccg acaacaatag tatgccccat ggtgcagtat ctagttacgc caaattagtg 60caaaaccaaa cacctgaaga cattttggaa gagtttcctg aaattattcc attacaacaa 120agacctaata cccgatctag tgagacgtca aatgacgaaa gcggagaaac atgtttttct 180ggtcatgatg aggagcaaat taagttaatg aatgaaaatt gtattgtttt ggattgggac 240gataatgcta ttggtgccgg taccaagaaa gtttgtcatt taatggaaaa tattgaaaag 300

 atcgtgcatt ctccgtcttt attttcaatg aacaaggtga attactttta 360ggtttactac

caacaaagag ccactgaaaa aataactttc cctgatcttt ggactaacac atgctgctct 420

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ggcgctatta ctgcggcggt gagaaaacta gatcatgaat taggtattcc agaagatgaa 540actaagacaa ggggtaagtt tcacttttta aacagaatcc attacatggc accaagcaat 600gaaccatggg gtgaacatga aattgattac atcctatttt ataagatcaa cgctaaagaa 660aacttgactg tcaacccaaa cgtcaatgaa gttagagact tcaaatgggt ttcaccaaat 720gatttgaaaa ctatgtttgc tgacccaagt tacaagttta cgccttggtt taagattatt 780tgcgagaatt acttattcaa ctggtgggag caattagatg acctttctga agtggaaaat 840gacaggcaaa ttcatagaat gctataa 867<210> 12<211> 134<212> PRT<213> 人工序列<400> 12Met Ile Glu Leu Asp Tyr Val Lys Gly Glu Asp Thr Ile Val Glu Ala1  5  10  15Thr Ser Thr Ser Pro Trp Leu Met Arg Ser Pro Leu Ala Arg Ala Ala 20  25  30Glu Lys Arg Gly Ser Gly Leu Phe Phe Asp Ile Asn Glu Gly His Gly 35  40  45Gln His Arg Asp Val Ile Val Ala Tyr Gly Val Ser Lys Pro Lys Arg 50  55  60Arg Ser Pro His Pro His Gly Asn Lys Ala Ala Asp Lys Arg Lys Thr65  70  75  80Thr Glu Lys Glu Pro Glu Arg Lys Lys Arg Val Gly Ala Pro Arg Thr 85  90  95Cys Lys Lys Ile Cys Ile Gln Leu Leu Tyr Arg Phe Asn Phe Thr Val 100  105  110

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序　列　表

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Leu Gly Ile Gly Asn Val Cys Asn Ile Asp Leu Leu Leu Gly Thr Val 115  120  125Ser Ala Thr Asn Ala Ile 130<210> 13<211> 405<212> DNA<213> 人工序列<400> 13atgatagaat tggattatgt aaaaggtgaa gataccattg tagaagcaac cagcacgtcg 60

 tgaggtctcc tcttgcccgg gccgcagaaa agaggggcag tggcctgttt 120ccgtggctga

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accgaaaagg aaccagaaag aaaaaagagg gtgggcgcgc cgcggacgtg taaaaagata 300tgcatccagc ttctatatcg ctttaacttt accgttttgg gcatcgggaa cgtatgtaac 360attgatctcc tcttgggaac ggtgagtgca acgaatgcga tatag 405<210> 14<211> 688<212> DNA<213> 人工序列<400> 14ggaacagctg atgaagcagg tgttgttgtc tgttgagagt tagccttagt ggaagccttc 60tcacattctt ctgttttgga agctgaaacg tctaacggat cttgatttgt gtggacttcc 120ttagaagtaa ccgaagcaca ggcgctacca tgagaaatgg gtgaatgttg agataattgt 180tgggattcca ttgttgataa aggctataat attaggtata cagaatatac tagaagttct 240cctcgaggat ataggaatcc tcaaaatgga atctatattt ctacatacta atattacgat 300tattcctcat tccgttttat atgtttatat tcattgatcc tattacatta tcaatccttg 360cgtttcagct tccactaatt tagatgacta tttctcatca tttgcgtcat cttctaacac 420cgtatatgat aatatactag taatgtaaat actagttagt agatgatagt tgatttctat 480tccaacacat ctactaacta gtatttacgt tactagtata ttatcatata cggtgttaga 540agatgacgca aatgatgaga aatagtcatc taaattagtg gaagctgaaa cgcaaggatt 600gataatgtaa taggatcaat gaatattaac atataaaacg atgataataa tatttataga 660attgtgtaga attgcagatt ccctttta 688<210> 15<211> 875<212> DNA<213> 人工序列<400> 15ttggtctttt tattttttat tttttttttc gttgcaaaga tgggttgaaa gagaagggct 60

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序　列　表

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ttcacaaagc ttcccgagcg tgaaaggatt tgcccggaca gtttgcttca tggagcagtt 120ttttccgcac catcagagcg gcaaacatga gtgcttgtat aagtttagag aattgagaaa 180agctcatttc ctatagttaa caggacatgc ctttgatatg aaaaaaaata ctacgaacta 240cgattttacc aagaaagatg taagagacaa gtgaacagtg aacagtgaac agtggggaca 300tttttttttt aagtaaatgg cagtttctag ggaatgatga tggcaagttc cagagaggca 360gcgtaaaagg atgaggctac tgggaagaag aaagaggaaa agtgcaagat gaatagccag 420tgcaatatat acatgtatac ttaacagata tggaatggtt ggcgaagtaa atttttggcg 480acgcggcgac gcggcgacgc ggtatgcgga gttgtaagat gtactacgat catatagtgt 540aatgcggcaa aatgttagtg caggaaagcg ggaaggaata agaagcaact aaacgagggt 600gtagaaaaag acgaagagga aagtattaac cgtagaagag agggaaatgg agggaagaga 660

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cataggaagc caagaaacta gaaaaaagaa ataaa 875

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说　明　书　附　图

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图1

图2

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说　明　书　附　图

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图3

图4

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说　明　书　附　图

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图5

图6

图7

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