提取方法对大黄蒽醌类成分及抗氧化活性的影响

提取方法对大黄蒽醌类成分及抗氧化活性的影响

刘建华,韩立强,苑丽,潘玉善,张素梅　(河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002)

摘要　[目的]比较提取方法对大黄蒽醌类成分和抗氧化活性的影响。[方法]采用超声及回流、索氏、微波4种提取方法,测定游离蒽醌

和总蒽醌的量,并采用DPPH、FRAP2种方法测定抗氧化活性,分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。[结果]游离蒽醌的测定中,超声为最高(0.949%),与其他方法相比差异显著(P<0.05);总蒽醌的测定中,亦以超声为最高(1.017%),与微波、回流相比差异显著(P<0.05);抗氧化活性测定发现,以回流抗氧化能力和清除自由基能力最强,FRAP值为199,DPPH值达51%,与超声和索氏的相比差异显著(P<0.05);相关性分析发现,总蒽醌含量与FRAP值和DPPH值负相关,相关系数分别为-0.9563和-0.9523。[结论]显示不同提取方法影响大黄蒽醌类成分和抗氧化活性,总蒽醌含量和抗氧化活性负相关。关键词　提取方法;大黄;蒽醌类成分;分光光度法;抗氧化

+

中图分类号　S567.239　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)22-09484-03EffectsofExtractionMethodsonAnthraquinoneComponentsandtheAntioxidantActivityinRhubarb

LIUJian2huaetal　(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinaryEngineering,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002)

Abstract　[Objective]Theresearchaimedtocomparetheeffectsofdifferentextractionmethodsonanthraquinonecomponentsandantioxidantactivityinrhubarb.[Method]Freeanthraquinoneandtotalanthraquinonewereextractedby4kindsofextractionmethodsincludingultrasonicmethod,reflux

method,Soxhletmethodandmicrowavemethodandtheircontentsweredetermined.TheirantioxidantactivitiesweredeterminedbythemethodsofDPPHandFRAP.Andthecorrelationbetweenanthraquinonecomponentsandtheantioxidantactivitywasanalyzed.[Result]Thecontentoffreeanthraquinonebyultrasonicextractionmethodwasthehighest(0.949%)withsignificantdifferencewiththatbyotherextractionmethods(P<0.05).Thecontentoftotal

(P1　材料与方法1.1　试验材料　

1.1.1　药品药材等。大黄素对照品(中国药品生物制品检

明医疗仪器厂);回流提取装置;索氏提取装置。

1.2　试验方法

1.2.1　对照品溶液的制备。精密称取大黄素对照品(105℃

干燥至恒重)4.1mg,置50ml量瓶中,加甲醇溶解,定容至刻度。精密吸取上述溶液1ml,置10ml量瓶中,加0.5%醋酸镁-甲醇溶液至刻度,作为对照品溶液。

1.2.2　系统适用性试验。

1.2.2.1　测定波长的选择。取大黄素对照品适量,用0.5%

醋酸镁-甲醇溶液溶解,在400～600nm波长扫描,大黄素在

510nm处有最大吸收,故选510nm作为检测波长。

定所,批号1107562200110,供含量测定用,经归一化法标定

98.0%);二苯代苦味酰基自由基(1,12pheny222picrylhydrazyl,DPPH)Sigma;TPTZ(2,4,62tripyridyl2s2trizine)Sigma;大黄药材(购自河南仟僖堂医药公司,经河南中医学院曹继华教授鉴

定为正品)。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2　仪器。JY922Ⅱ超声波细胞破碎仪(宁波新芝科器所);微

图1　大黄素的吸收光谱

Fig.1　Absorptionspectraofemodin

波炉(广东美的微波炉制造有限公司);UV22800紫外分光光度计(尤尼柯(上海)仪器厂);酸度计(意大利哈钠);微量移液器

(eppendorf);Sartorius电子天平(型号1702,称量范围200g,感量);FZ102微型植物试样粉碎机(北京市永光0.1mg,德国Sartorius

作者简介　刘建华(1977-),女,河南浚县人,在读博士,讲师,从事天然药物的活性物质基础研究。收稿日期　2008205214

1.2.2.2　线性关系考察。精密称取大黄素对照品(105℃干燥

至恒重)4.1mg,置50ml量瓶中,甲醇溶解,定容至刻度。精密吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0ml,分别置于10ml量瓶中,加0.5%醋酸镁-甲醇溶液至刻度,放置20min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白,分别测定溶液在510nm处的吸光度。以吸光度对浓度进行线性回归,得到回归方程:Y=0.0443X+

36卷22期　　　　　　　　　　　　　刘建华等　提取方法对大黄蒽醌类成分及抗氧化活性的影响5849

0.0137,线性范围为3.28～16.4μg/ml,r=0.999。

1.2.2.3　精密度试验。取“1.2.1”项对照品溶液,重复测定5

的容量瓶中,酸水层继续用氯仿萃取3次(20、15、15ml),并入上述100ml的容量瓶中,精密吸取30ml,蒸馏水洗至中性,置水浴上挥干氯仿层,残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解,定容至10

ml的容量瓶中,摇匀,放置20min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液

次,测得的吸光值RSD为1.0%(n=5)。

1.2.2.4　重现性试验。取大黄5份,按“1.2.4.3”项下供试品

溶液的制备方法制备,并依“1.2.5”“、1.2.6”项下的方法分别测定游离蒽醌和总蒽醌的吸光值,测得的吸光值RSD分别为2.3%、3.5%(n=5)。

1.2.2.5　稳定性试验。精密称取大黄素对照品和大黄适量,

为空白,测定其在510nm处吸光度值。

1.2.7　抗氧化活性的测定[5]。

1.2.7.1　总抗氧化能力的测定[5]。取“1.2.4”项下各供试品

溶液,适当稀释后用移液器取100μl,加入FRAP工作液(300

mmol/L醋酸盐缓冲液,10mmol/LTPTZ,20mmol/LFeCl

3)

按“1.2.1”和“1.2.4.3”项下的方法制备供试品溶液,并按“1.2.5”“、1.2.6”项下的方法测定,每间隔20min测定吸光度,共测6次,结果大黄素标准品、大黄游离蒽醌、大黄总蒽醌的吸光值RSD分别为1.7%、2.1%、2.4%,表明大黄素标准品和大黄样品的吸光度值在2h内基本稳定。

1.2.2.6　加样回收率试验。精密称取上述已知含量的大黄

3

ml,混匀反应20min,于593nm处读取吸光度,以FeSO4为标

准物质绘制标准曲线,样品的抗氧化能力以FRAP值表示:

1FRAP单位=1mmol/LFeSOFeSO4的mmol/L数。

1.2.7.2　清除自由基能力的测定[6]。取“1.2.4”项下各供试

4

,即样品的抗氧化能力相当于

粉末约0.1g,加入82μg/ml大黄素甲醇溶液1ml,按品溶液,适当稀释后用移液器取100μl,加入2ml0.2mmol/L

DPPH的乙醇溶液,混合均匀,黑暗下室温避光反应20min,

“1.2.4.3”项方法制备供试品溶液,测定回收率,结果游离蒽醌、总蒽醌的平均回收率分别为99.7%、101.2%,RSD分别为2.8%、1.7%(n=5)。

1.2.3　样品的前处理。将供试品经过干燥,采用微型植物试)干燥24h样粉碎机进行粉碎,过60目筛,粉末经恒温(60℃

在517nm处测定吸光度,同时以2mlDPPH+100μl缓冲溶液混合后的吸光度为空白组,计算清除率(%)=(1-药品组

A517/空白组A517)×100%。1.2.8　数据统计。以上数据采用SPSS11.0软件进行显著性

后,放干燥器中,备用。

1.2.4　供试品溶液的制备[3]。1.2.4.1　回流提取液的制备。精密称取“1.2.3”项下样品约0.1g,置50ml的圆底烧瓶中,加70%的乙醇回流提取3次,

分析,多重比较采用Duncan检验,以提取方法为控制因素进行偏相关分析,Excel作图。

2　结果与分析

2.1　不同提取方法对大黄中游离蒽醌含量的影响　由图2

提取时间分别为1.5、1、1h,乙醇用量分别为20、15和15ml,合并3次回流提取液,定容至100ml的容量瓶中,备用。

1.2.4.2　索氏提取液的制备。精密称取“1.2.3”项下样品约0.1g,采用70%乙醇进行索氏提取,提取至无颜色为止(约6h),提取液定容至100ml的容量瓶中,备用。

1.2.4.3　超声提取液的制备。精密称取“1.2.3”项下样品约0.1g,置50ml的三角瓶中,70%的乙醇超声提取3次,每次3min(每次辐射时间为10s,间隙10s,工作18次),乙醇用量分

可知,4种提取方法对大黄中游离蒽醌的提取率以超声提取为最高,求得游离蒽醌的含量为0.949%,与其他方法相比差异显著(P<0.05);其次为索氏和微波提取,百分含量分别为

0.604%、0.596%;回流提取法最低,为0.447%,与其他方法

相比差异显著(P<0.05)。

别为20、15、15ml。合并3次的超声提取液,定容置100ml的容量瓶中,备用。

1.2.4.4　微波提取液的制备。精密称取“1.2.3”项下样品约0.1g,置50ml的三角瓶中,70%的乙醇微波提取3次,每次1min(每次工作时间为10s,间隙60s,工作6次),乙醇用量分

别为20、15、15ml。合并3次的微波提取液,定容置100ml的容量瓶中,备用。

1.2.5　游离蒽醌的测定。分别精密吸取“1.2.4”项下各供试

注:W.微波提取,S.索氏提取,C.超声提取,H.回流提取;各组间不同字母表示差异显著(P<0.05)。以下同。

Note:W.Microwaveextraction;S.Soxhletextraction;C.Ultrasonicex

traction;H.Refluxextraction.Differentlettersamongvariousgroupsmeansignificantdifferenceat0.05level.Thesameasbelow.

品溶液10ml,水浴上蒸干,再加20ml蒸馏水溶解,加氯仿萃取3次(20、15、15ml),合并3次氯仿萃取液,定容至50ml的容量瓶中,精密吸取15ml,水浴上蒸去氯仿,残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解,定容至10ml的容量瓶中,摇匀,放置

20min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白,测定其在510nm

22

图2　不同提取方法对大黄中游离蒽醌含量的影响

Fig.2　Effectsofdifferentextractionmethodsonfreeanthraquinone

contentinrhubarb

处吸光度值。

1.2.6　总蒽醌的测定[4]。分别精密吸取“1.2.4”项下各供试品

溶液10ml,水浴上蒸干,加2.5mol/L的硫酸20ml水解2h,稍冷,加氯仿20ml继续水解2h。放置至室温后,转移至分液漏斗内,用氯仿洗涤烧瓶,并入分液漏斗中,分取氯仿层置100ml

2.2　不同提取方法对大黄中总蒽醌含量的影响　图3显

示,在对总蒽醌的测定中,4种提取方法中以超声提取为最高,总蒽醌的含量为1.061%;其次为索氏,百分含量为

6849　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年

1.017%。这2种方法提取的总蒽醌含量差异不显著(P>0.05),但与微波和回流相比差异显著(P<0.05),微波和回

0.05);回流和微波提取液的清除自由基能力与超声和索氏

的差异显著(P<0.05)。

2.5　蒽醌含量与抗氧化活性间的相关关系　由表1可知,

流提取的总蒽醌含量较低,分别为0.872%和0.766%。

游离蒽醌的含量与总蒽醌的含量有相关性,相关系数达

0.8306(P<0.05),游离蒽醌与FRAP值和自由基清除率的

相关系数差异不显著,总蒽醌与FRAP值和自由基清除率具有显著负相关,相关系数分别为-0.9563

-0.9523(P<0.05)。

表1　游离蒽醌、总蒽醌与抗氧化活性的相关关系

Table1　Relationshipbetweenfreeanthraquinone,totalanthraquinoneand

antioxidantactivity

(P<0.05)和

游离蒽醌总蒽醌

Freeanthr2Totalanthr2

图3　不同提取方法对大黄中总蒽醌含量的影响

Fig.3　Effectsofdifferentextractionmethodsontotalanthraquinone

contentinrhubarb

aquinone

aquinone0.83061

FRAP值

FRAPvalue-0.6608-0.9563(P=0.01)

1

DPPH清除率ScavengingrateofDPPH-0.6589

(P=0.107)

游离蒽醌

Freeanthraquinone

1

(P=0.021)(P=0.101)

2.3　不同提取方法对大黄抗氧化活性的影响　图4显示,

总蒽醌

TotalanthraquinoneFRAP值FRAPvalue

-0.9523

(P=0.01)

以回流和微波提取液的抗氧化能力最强,FRAP值分别为199和195,这2种提取液的抗氧化能力差异不显著(P>0.05),但与超声和索氏相比差异显著(P<0.05);超声提取液的

FRAP值为104,索氏提取液的为97,超声与索氏提取液的抗0.9960(P<0.001)

1

自由基清除率ScavengingrateofDPPH氧化能力无显著性差异(P>0.05)。

3　结论与讨论

(1)该试验所测得的蒽醌含量与《中国药典》规定的5种

蒽醌类总量相比偏低,可能是该方法只采用大黄素一种标准品,不是其他蒽醌类成分的最大吸收,故较HPLC结果偏低。

(2)对蒽醌类成分的显色,多为碱液显色,但通过预试验

发现,醋酸镁-甲醇显色较为稳定,且醋酸镁反应所呈颜色为红色,杂质干扰少。最大吸收在510nm,显色20min后吸光度趋于平稳,因此测定应在20min～2h完成。

(3)对测定过程中,萃取后的氯仿层必须用蒸馏水洗至

中性,否则,会大大影响加入醋酸镁-甲醇以后的吸光度,从

图4　不同提取方法对大黄抗氧化能力的影响

Fig.4　Effectsofdifferentextractionmethodsonantioxidantcapacity

inrhubarb

而影响试验结果。

(4)二苯代苦味酰基自由基(DPPH)在有机溶剂中是一种

稳定的自由基,其乙醇溶液呈紫色,在517nm有强吸收,当加入自由基清除剂时,其结构中的孤对电子被配对,吸光度变小,因此可以测定物质的自由基清除能力。FRAP法的原理是基于氧化还原反应,在酸性pH值下Fe3+与TPTZ形成复合物(Fe3+-TPTZ),在还原物质的作用下,复合物被还原为二价铁而呈明显的蓝色,在593nm达最大吸收,其吸光度的变化与还原物质的含量呈比例关系,可以作为测定物质总抗氧化能力的一种方法。试验表明,4种方法的大黄提取液均能有效还原Fe3+和清除DPPH自由基,其中回流和微波提取液的抗氧化活性强于超声和索氏,从相关关系看,其抗氧化活性与提取物中的总蒽醌含量呈显著负相关,其原因有待进一步研究。

2.4　不同提取方法对大黄清除自由基能力的影响　图5

显示,以回流提取液的清除自由基能力最强,自由基清除率

图5　不同提取方法对大黄清除自由基能力的影响

Fig.5　Effectsofdifferentextractionmethodsonthescavengingabili2

tyoffreeradicalsinrhubarb

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,

2005:145.

[2]王棋.不同提取方式对大黄抗氧化作用的影响[J].包头医学,2004,28

(4):28-30.

[3]金波,李薇,蔡伟.大黄总蒽醌提取与纯化工艺的研究[J].时珍国医国

达51%,其次是微波提取液,达48%,这2种提取液的清除自由基能力差异不显著(P>0.05);超声与索氏提取液的清除自由基能力分别为27%和24%,二者无显著性差异(P>

(下转第9509页)

36卷22期　　　　　　　　　　　　　　　　　陈坤　论空中南水北调9059

区降水量恢复到正常年份时,随着森林覆盖率进一步提高,降水量增加将趋缓。

4.3　南方、东北内蒙森林覆被变化对华北降水量的影响分

元/hm2。三是基础设施成本,包括林区公路、供水设施等,在

7200元/hm2。这3项的总成本为:

C=ΣCi=25200～28200元/hmi=1

3

2

析　研究表明,如果南方有林面积提高1%,那么,华北降水将增加7.8%;北方有林面积提高1%,华北降水将增加8.6%。

由于南方雨热条件好,树木生长快,宜林荒地多,因此,在南方植树的成本要比北方少,潜力比北方大。因此,笔者认为应该主要考虑在南方进行植树造林来增加华北的降水。如果将南方森林覆盖率提高1%,即南方12个省区增加250.3万hm郁闭度在0.4以上的成熟林面积,华北地区的降水量将增加50多mm,折算成水量为30多亿m3。

5　森林增雨的经济学分析

5.1　森林的收益分析　森林所带来的收益有2个部分:一

2

在不计算森林对森林所处流域外的增雨功能时,仅计算森林对森林所处流域内所带来的投资收益比超过了1∶20。

6　结论

根据上文的初步估算:当南方森林覆盖率提高1%,即增加郁闭度在0.4以上的成熟林面积250.3万hm2时,华北地区降水量增加30多亿m3。

南方森林覆盖率提高1%,需要投资人民币668亿元。但森林给造林地区带来的收益将达到13360亿元。除去成本,净收益将超过1200亿元。

经比较,南水北调东线一期工程的投资为74亿元,调水量为37亿m3。因此,粗略估计,南方森林覆盖率提高1%给华北增加的降水量与南水北调一期工程的调水量相当;其成本虽较南水北调东线一期工程的大,但效益却有天壤之别。南方植树除了给北方增雨外,还将给造林地区带来净生态正效益。而南水北调虽然同样给华北地区增加了供水,但给水量调出区带来净生态负效益。一增一减,南方植树所带来的效益将远远大于南水北调所产生的效益。当然也要看到,因为降水的利用效率比调水的利用效率低,在没有很好的集水条件和很好的水土保持等生态条件下,降下的水要不被白白地流掉而浪费,要不被大量蒸发而无法利用,需要改善降水区的生态条件而提高降水地区的土壤、植被的持水能力;也需要在当地植树造林,改善当地的生态环境,为提高降水利用效率打下基础;同时,也需要修建一些集水工程,以提高降水的利用效率。

因此可以初步认为,通过在南方或东北植树造林来增加华北地区的降水是解决华北水危机的最优方案。参考文献

[1]陈坤.解决华北水危机可选方案成本探讨[J].社会科学,2004(12):6-13.

[2]马雪华.森林水文学[M].北京:中国林业出版社,1992.

[3]刘世荣.中国森林生态系统水文生态功能[M].北京:中国林业出版社,

1996.

(1):4-30,200.[4]竺可桢.东南季风与中国之雨量[J].地理学报,1934

[5]张家诚.水分循环与气候背景[J].水科学进展,1999,10(3):66-71.

(2):43-46.[6]王宏昌.西北干旱问题[J].开发研究,1993

[7]王宏昌.中国西部气候—生态演替:历史与展望[M].北京:经济管理出

版社,2001:86.

[8]王茂林.新中国城市经济50年[M].北京:经济管理出版社,2000.

[9]郁文艳.我国森林旅游去年综合产值近800亿元[N].中国绿色时报,

2007201211.

[10]高保生.中国成林产品生产大国去年林业总产值突破1万亿[N].人

民日报,2007-9-16.

[11]根据南方木材交易中心提供的数据计算[EB/OL].(2007205216)[20082

05212]http://www.wzdragon.net/NewsView.asp?id=109.2007-5-16

是森林给森林所处流域外(该文主要指华北地区)所带来的收益,主要是指生态(降水)收益———给华北地区增雨而产生的收益,与南水北调、海水淡化、节水的功效一致。上文已作了分析。二是森林给森林所处流域内所带来的收益。这些收益体现在以下几个方面。

(1)森林的生态功能所产生的收益。森林的生态功能主

要表现在产氧量、保持土壤功能、吸收二氧化硫量、滞尘量、蓄水量、调温等几个方面。天津园林局贺振、徐金祥研究了瑞典、前苏联、日本以及国内的大量测算方法,汇总成“园林效益测算公式”。用该公式测试森林的产氧量、吸收二氧化硫量、滞尘量、蓄水量、调温等几个方面的价值为每公顷森林能产生538854元的价值[8]。

(2)以森林为依托的旅游收益。调查显示,2006年,全国

以森林为依托的森林旅游产业达800亿元,经营森林面积

1513万hm2[9],因此每公顷森林带来的效益是5287.5元。而

且,随着森林面积的扩大,收益将进一步扩大。

(3)保护生物多样性功能所产生的收益。通过实际市场

收益资本化方法可以计算森林保护生物多样性所产生的收益。2006年我国经营森林面积为1513万hm2,在当年,我国国营森林通过多种经营实现产值2420亿元(木材、旅游除外)[10],每公顷产值为15994.7元。因此,每公顷森林给所处流域内所带来的收益为:

E=∑Ei=538854+5287.5+15994.7=560136.2

i=1

3

(元/hm2)

5.2　植树的成本分析　根据广东、广西造林的经验,荒山造

林成本主要由3大块所构成[11]:一是土地成本,一般在1350～1800元/hm2。二是造林成本,包括育苗、炼山、林地清理、挖穴、种植、供水、肥料、规划、管理等,在16650～19200

(上接第9486页)

　　药,2005,16(8):756-758.

[4]伍晓春,陆豫,张振辉.虎杖总蒽醌的超声波法提取[J].南昌大学学

报,2005,29(3):282-285.

[5]BENZIEIF,STIAINJJ.Theferricreducingabilityofplasmaasameasureof“antioxidantpower”:TheFRAPassay[J].AnalBiochem,1996,239:70-76.[6]韩立强,杨国宇,王艳玲,等.肌肽对DPPH自由基清除效果的研究[J].

河南农业大学学报,2006,40(2):164-167.