基于AFP抗原的AFP纳米抗体A83[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 1050374 A (43)申请公布日 2015.11.11

(21)申请号 201510430150.0(22)申请日 2015.07.21

(71)申请人南昌大佳科技有限公司

地址330000 江西省南昌市高新区高新二路

18号高新创业大厦(72)发明人付金衡 何庆华 许杨 涂追

陈静(74)专利代理机构南昌新天下专利商标代理有

限公司 36115

代理人施秀瑾(51)Int.Cl.

C07K 16/18(2006.01)C12N 15/13(2006.01)G01N 33/68(2006.01)

权利要求书1页 说明书7页序列表7页 附图1页

()发明名称

基于AFP抗原的AFP纳米抗体A83(57)摘要

本发明属于生物技术领域，涉及特异性结合甲胎蛋白的驼源免疫纳米抗体(单域重链抗体，VHH)及其应用。该抗体氨基酸序列为SEQ ID NO.:1，还涉及编码该氨基酸的核苷酸。本发明甲胎蛋白纳米抗体可以作为抗体应用于非疾病诊断治疗目的免疫学检测AFP。驼源免疫VHH较于Scfv抗体、Fab抗体具有较高特异性、高亲和力，结构更加稳定、耐酸碱和高温、检测灵敏度高等特性，因此其免疫检测稳定性得到了极大的提升，同时对环境的耐受能力也得到了提升。

C N 1 0 5 0 3 7 5 4 4 A CN 1050374 A

权 利 要 求 书

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1.基于AFP抗原的AFP纳米抗体，其特征在于具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述AFP纳米抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO.:9。3.如权利要求1所述AFP纳米抗体的制备方法，其特征在于驼源免疫的单域重链抗体库中筛选能与靶分子特异性结合的单域重链抗体，并通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示有AFP单域重链的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有AFP纳米抗体的噬菌体粒子；所述基因工程重组表达的方式是指将纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行纳米抗体的大量制备。

4.权利要求1所述AFP纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。5.如权利要求4所述应用，其特征在于AFP纳米抗体替代AFP单抗在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。

6.权利要求1所述AFP纳米抗体在制备结合吸附AFP试剂中的应用。

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说 明 书

基于AFP抗原的AFP纳米抗体A83

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技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合甲胎蛋白(Alpha-Fetal Protein，AFP)的纳米抗体(单域重链抗体，Variable domain of heavy chain of heavychain antibody,VHH)及其应用。

[0001]

背景技术

甲胎蛋白是一种糖蛋白，由胎肝或成人肝脏产生，常见于在孕妇和婴儿的血液中，

但在健康成人血液中含量很少，目前主要用于原发性肝癌的早期诊断、疗效评估和预后评价，是原发性肝癌(PHC)重要的血清学标志物。甲胎蛋白作为一种标志物在多种肿瘤中，尤其肝细胞癌(HCC)中有着过度表现。随着对AFP基因结构及功能的进一步深入研究，其在HCC的早期诊断及生物学治疗中越来越重要的作用。在其他肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者也出现不同程度的升高。当肝细胞发生癌变时，会产生这种AFP，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。

[0003] 临床检测患者AFP的常规方法有放射性免疫法(RIA)，酶免疫法(EIA)和胶体金法，目前化学发光免疫检测技术(CLIA)因其具有反应快、灵敏度高、准确度高，标记物稳定、对人体无放射性或毒性危害且特异性强等特点，是目前为止公认最好的微量定量检测方法。在检测研究性实验当中，需要大量的抗体应用于新型的、高效的检测方法的研究。纳米抗体具备了特异的抗原结合能力及高亲和力，显示出了独特性质及在研究领域的巨大应用潜能。且抗体以及抗原标准品非常昂贵，而且有些毒素具有危险性。

[0002]

发明内容

本发明利用噬菌体展示技术，从驼源免疫的单域重链抗体库中筛选能与靶分子(AFP抗原)特异性结合的单域重链抗体(VHH)噬菌体克隆，以VHH作为AFP抗体应用于免疫学分析检测领域。该方法筛选得到的VHH具有与AFP免疫反应特性，且特异性好、高亲和力，可应用于AFP的免疫学检测。本发明以AFP标准品为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入驼源免疫的单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种抗AFP纳米抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT编号和结构域划分如图1所示。[0005] 本发明所提及的AFP纳米抗体(VHH)包括四个框架区(Framework region,FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)。其中，框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8，互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。

[0004]

本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有90％同源性。

[0006]

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说 明 书

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本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80％同源性。

[0008] 本发明还涉及编码AFP抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO.:9。[0009] 本发明提及的基于AFP结合的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有AFP纳米抗体(VHH)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有AFP的纳米抗体(VHH)的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行AFP抗体的大量制备。

[0010] 本发明还涉及所述AFP纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。[0011] 本发明AFP纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有AFP纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测以及将AFP纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。

[0012] 本发明还涉及AFP纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用，具体为AFP纳米抗体在制备吸附AFP的纳米抗体试剂中的应用。比如，可以将本发明AFP纳米抗成免疫亲和柱，吸附抓取AFP，富集，以供进一步的研究等。[0013] 本发明所述的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和力、特异性和稳定性等)更好的突变体。[0014] 本发明中所叙述的一些术语具有如下含义：[0015] 同源性：描述两个或多个氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列之间的同源性百分比可以通过【第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置处的氨基酸残基相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】再乘以【100％】来计算，其中第二氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与第一氨基酸相比)被认为是有差别。另外，同源性百分比也可以利用已知的用于序列比对的计算机运算程序(如：NCBI Blast)获得。[0016] 结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。[0017] IMGT编号：IMGT数据库(The International ImMunoGeneTics Database)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(Ehrenmann,F.,Q.Kaas,et al.(2010).\"IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF.\"Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,et al.(2003).\"IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.\"Dev Comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。

密码子(codon)：亦称三联体密码(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核苷

酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。[0019] 本发明的有益效果是：纳米抗体分子结构独特，分子量小，稳定易表达，且特异性

[0018]

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说 明 书

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好，可以代替传统的单克隆抗体，避免了繁琐的制备过程，而且节约成本。本发明制备的AFP抗体可以广泛用于AFP基础研究，医学诊断和检测，抗体药物开发等。本发明的纳米抗体方法具有普遍适用性，可用于其他小分子物质模拟抗原的筛选和制备，具有很高的应用价值。附图说明

图1为AFP纳米抗体(VHH)的氨基酸编号及结构域示意图。[0021] 图2为图1 AFP双抗夹心ELISA标准曲线及CAE、NSE、CA-125交叉反应曲线。噬菌体克隆检测AFP的最低检测限分别为1.21ng/mL，线性关系分别为0.9831，线性范围均为1-200ng/mL。

[0020]

具体实施方式

[0022] 实施例1.驼源免疫单域重链抗体库的构建[0023] 1)羊驼的免疫：

[0024] 选取一只健康成年羊驼，采取背部皮内、皮下多点注射的方式进行免疫，初次免疫，弗式完全佐剂，免疫原剂量1mg；第28天二次免疫，弗式不完全佐剂，免疫原剂量0.5mg，第49天三免，弗式不完全佐剂，免疫原剂量0.25mg；第70天四免，弗式不完全佐剂，免疫原剂量0.25mg。第三次加强免疫后第七天，采集羊驼外周血，用于构建噬菌体展示文库。[0025] 2)驼源白细胞的分离：在离心管中加入淋巴细胞分离液，再加入血液样品，700g离心20min；小心吸取中间层悬浮的白细胞至一新的离心管中，加入1/2体积的PBS，800g离心15min；弃上清，用PBS洗下离心管壁上的白细胞，850g离心10min；弃上清，300μL PBS重悬白细胞并计数；以体积比1：10加入裂解液(RNAiso)保存备用。[0026] 3)总RNA提取：向上述裂解液中加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡15s使其充分乳化，室温静置5min；4℃12000g离心15min，取上清转移至另一新鲜离心管中；加入等体积的异丙醇，充分混匀后室温静置10min；4℃12000g离心10min，弃上清，缓慢加入75％乙醇1mL，小心洗涤离心管管壁；4℃，12000g离心5min后弃去乙醇；室温干燥沉淀5min，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。[0027] 4)cDNA的合成：将反转录用的引物、dNTP Mixture和模板RNA混合，65℃5min，迅速冰浴。具体配制如下：

[0028]

[0029] [0030]

然后在上述Microtube中配置下列反转录反应液：

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说 明 书

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PCR仪上按下列条件进行反转录反应：42℃30min，50℃30min，70℃10min。PCR产物于-20℃保存备用。

[0032] 5)抗体可变区基因扩增：将反转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应。[0033] 第一轮PCR：

[0031] [0034]

PCR反应条件：94℃4min；98℃10s，55℃15s，72℃45s，30cycles；72℃7min。

[0036] 采用试剂盒回收PCR扩增产物，适当稀释后作为第二轮PCR的模板。[0037] 第二轮PCR：

[0035] [0038]

[0039]

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说 明 书

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PCR反应条件：94℃4min；98℃10s，50℃15s，72℃45s，5cycles；98℃10s，68℃40s，30cycles；72℃7min。[0041] 6)文库构建：

[0042] A.VHH编码基因及载体的双酶切

[0043] 分别采用Sfi I和Not I酶对VHH编码基因和pHEN1载体进行双酶切。[0044] B.酶切后产物的连接

[0040]

将载体pHEN1和VHH片段混匀(摩尔比1∶5)，于16℃连接12h。先后加入

5μL(1/10量)的3M CH3COONa(pH 5.2)和125μL(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20℃静置1h，12000rpm离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，室温干燥，溶于10μL去离子水中。[0046] C.电转化

[0047] 取5μL连接产物加至80μL感受态细胞E.coli TG1中，充分混匀，冰上放置1min。转入0.1cm的电击杯中电击转化(电压为1.8kV)，立即向电击杯中加入900μL SOC培养基，37℃180rpm培养1h。将菌液涂布于SOB-AG平板，37℃倒置培养过夜。[0048] 7)文库的救援：接种超过10倍库容量的细胞于100mL2×YT/amp/2％葡萄糖，培养至OD600达0.5；加入辅助噬菌体(20:l感染复数)，37℃，静置15min后，220rpm培养45min；4℃，3000g离心10min；弃上清，加入100mL新鲜的2×YT/amp/kan培养基重悬沉淀，30℃培养过夜；4℃3000g离心10min，取上清；加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，4℃静置2h；4℃10000rpm离心20min，弃上清，沉淀用1mL PBS重悬；取10μL测定库容，其余加入终浓度50％甘油，-80℃保存。

[0049] 实施例2. AFP纳米抗体的亲和淘选及其鉴定[0050] 1)AFP作为靶分子的生物素化

[0051] A.将2mg靶蛋白溶于1mL 50mM的NaHCO3(pH 8.5)中；[0052] B.用前，溶解1mg Sulfo-NS-LC-生物素于1mL水中，震荡混匀。加74μL此溶液到靶蛋白溶液中；

[0053] C.将管冰上放置2h；

[00] D.透析除去未反应的生物素，用PBS缓冲液进行透析，至少更换两次透析液；[0055] E.用NaNo Drop对生物素化蛋白进行定量。[0056] 2)淘选

[0057] 用链霉亲和素(100μg/mL链霉亲和素溶于0.1M NaHCO3(pH 8.6)中)包被酶标板，4℃过夜。PBST(10mM PBS，0.5％Tween-20(v/v))洗涤4次后，加入300μL的3％

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说 明 书

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BSA-PBS 37℃封闭1小时(封闭液应含有0.1μg/mL的链霉亲和素以结合BSA封阻液中含有的生物素)，封闭板时预先将噬菌体与生物素化靶蛋白分子结合。1小时后弃封闭液，用PBST洗涤6次，将噬菌体-靶蛋白溶液加入到已清洗过的板中，室温温育15min。加入生物素至终浓度0.1mM继续温育10min。吸出未结合的噬菌体，用PBST洗涤10次，加入100μL的Glycine-HCl(0.2M,pH 2.2)洗脱10min后，立即用15μL 1M HCl(pH 9.1)中和。取10μL洗脱噬菌体测定滴度，其余的用于感染20mL生长至对数期的E.coli TG1菌株进行扩增。用PEG/NaCl沉淀扩增后的噬菌体，并测定噬菌体的滴度。[0058] 3)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮和第四轮淘选后测定噬菌体滴度的平板上随机挑取95个克隆，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法(Indirect Enzyme Linked immunoasorbent assay,I-ELISA)进行阳性噬菌体克隆的鉴定。具体方法为：首先，用PBS(pH 7.4)将AFP抗原稀释至2μg/mL，4℃包被过夜。第二天用PBST(10mM PBS,0.05％Tween-20(v/v))洗涤3次后，加入300μL的3％脱脂奶粉，37℃封闭1小时；弃封闭液，PBST洗涤3次后，加入100μL噬菌体扩增液(2.0×1011cfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37℃孵育1小时；加入1:5000倍稀释的HRP/anti-M13 100μL，37℃孵育1小时；加入100μL TMB底物溶液，避光显色10min；加入50μL终止液(2M H2SO4)终止反应；用酶标仪(Thermo Scientific Multiskan FC)测定450nm处的吸收值。选取OD450大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克隆。

[0059] 4)噬菌体展示VHH针对AFP特异性鉴定：CAE/CA-125/NSE交叉反应[0060] A.Anti-AFP单克隆抗体2.0μL/mL100μL，4℃包被过夜；[0061] B.PBS洗板3次，300μL3％BSA-PBS封闭，37℃封闭1h；[0062] C.分别加入CAE、CA-125、NSE抗原0、1、2、4、8、16、32、、128、256ng/mL于每孔中，37℃孵育0.5h；

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[0063] D.加入2×10cfu噬菌体，37℃孵育0.5h；[00] E.PBST洗板6次，加入HRP/anti-M13(工作浓度1/5000)，100μL/孔，37℃0.5h；[0065] F.用0.05％PBST洗板6次，加入显色液100μL/孔，37℃反应5min；[0066] G.加入50μL/孔的2M硫酸终止反应，测定450nm出的吸光度。[0067] 实施例3. AFP纳米抗体编码基因的测序及其氨基酸序列的确定

[0068] 将经过双抗夹心酶联免疫方法鉴定后的阳性噬菌体克隆进行DNA测序，根据DNA测序结果及密码子表可获得氨基酸序列。

[0069] 实施例4. AFP纳米抗体噬菌体的大量制备[0070] (1)以噬菌体扩增的方式进行制备

[0071] 将展示的纳米抗体噬菌体加入至20mL接种有E.coli TG1的培养物中，37℃220rpm振荡培养6h。并加入M13K07噬菌体，37℃摇床侵染1h。将培养物转入另一离心管中，4℃3000rpm，离心10min，去上清。用1mL培养基重悬沉淀，将重悬菌液加入20mL培养基中，1/1000的氨苄及卡那霉素，30℃培养过夜。去菌液4℃7500rpm离心将上清的上部80％转入一新鲜的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置120min后，4℃10000rpm离心10min，弃上清；再加入少量PBS清洗噬菌体。4℃10000rpm离心10min，弃上清，加入1mL PBS进行重悬，即为噬菌体扩增液。[0072] (2)以蛋白表达的形式进行制备

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说 明 书

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分别采用Nco I和Not I酶对外源编码VHH基因和表达载体(pET-25b)进行双酶切，将VHH编码基因克隆至表达载体pET-25b，经PCR和酶切验证后，将重组表达载体转入大肠杆菌Rosetta(DE3)。从转化平板上挑一单菌落接种于5mL LB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜，将过夜培养物按1％接种量(v/v)接种于50mL的LB/Amp，2％葡萄糖培养基中，37℃，220r/min振荡培养；当培养物菌体浓度OD600达到0.5时，向培养物中加入0.1mM的IPTG，30℃，220r/min振荡培养8-12h；将培养物于4℃，8000rpm，离心20min收集菌体沉淀。重悬细胞于5mL预冷的PBS溶液，超声破碎10min后，8000rpm离心20min取上清，将上清进行亲和层析纯化，即得AFP纳米抗体。[0074] 实施例5. AFP纳米抗体耐热实验

[0075] 为了确定本发明表达蛋白纳米抗体的热稳定性，将表达蛋白置于45℃环境中，分别在0、1、2、4、8、16、32h测定蛋白的免疫活性。在45℃孵育之前的蛋白免疫活性设为100％，

[0076] 1)包被Anti-AFP McAb于酶标板中，2μg/mL，100μL/孔，4℃包被过夜；[0077] 2)0.05％PBST洗板三次，3％的脱脂牛奶37℃封闭1h；[0078] 3)加入0.5μg/mL的AFP抗原，100μL/孔，37℃孵育0.5h；[0079] 4)加入稀释10、25、50、100、200、400、800、1600倍的目的蛋白溶液，37℃孵育0.5h；

[0080] 5)加入1：2000工作浓度的HRP酶标抗His二抗，37℃孵育0.5h；[0081] 6)加入TMB显色液，避光显色5min；[0082] 7)加入50μL/孔2M的H2SO4终止反应，测定450nm处紫外吸光度。[0083] 结果显示本发明VHH置于在45℃水浴后，其免疫检测性能(OD值)未见区别，显示出较好的耐热能。

[0084] 实施例6. AFP纳米抗体检测血清在ELISA中的应用

[0085] 为了验证噬菌体克隆能否成功用于检测血清中AFP抗原，随机从当地疾控中心(青山湖区疾控中心)抽取10份健康人的血清，稀释4倍，分别向血清中加入1、5、10、25、50、100ng/mLAFP抗原(AFP医学检测阈值为400ng/mL)，随机去三份血清，计算AFP的加标回收率。

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