单克隆抗体制备全攻略(二)

⑴单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。

A、杂交瘤细胞的染色体分析

对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一，杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64；同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点，除多数为端着丝点染色体外，还出现少数标志染色体。另一方面，杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。

检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法，其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/LKCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下：a.在加秋水仙素前48-36小时将杂交瘤细胞传代。

b.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20℃保存），使最终浓度为0.1-0.4ug/ml（若改用秋水仙胺则最终浓度为0.02-0.05ug/ml）；继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min10分钟，弃上清。

c.加入已预温到37℃的0.075mol/LKCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。

d.向悬液中加入新配制的固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）1ml，混匀，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。e.加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4℃过夜。f.取出离心管，1000r/min5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。

g.用新配制的10%Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/LPH6.8PBS9份，即成10%Giemsa染液）。h.镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

B、抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定

抗体的类和亚类对决定提纯的方法有很大的帮助。除采用特殊的免疫方法和检测方法，最经常得到的单抗是IgM和IgG，分泌IgE的杂交瘤细胞很少见，而分泌IgA的杂交瘤通常只有在用于融合的淋巴细胞来自肠道相关淋巴组织才能得到。如在抗体检测中使用葡萄球菌A蛋白试剂，则不可能得到IgG以外的其他类的抗体。鉴定单抗Ig类和亚类的方法主要有两种，一种是免疫扩散，另一种是ELISA。（A）免疫扩散法

这种方法简便、准确，最常用。被检的McAb样品通常为杂交瘤细胞培养上清液，由于其中单抗的浓度较低，应先将其浓缩10-20倍左右再检测。小鼠腹水中的单抗浓度虽很高，但也含有小鼠本身的各类Ig，它们也会与相应抗血清发生反应，使鉴定结果出现混乱，即使将腹水稀释10-20倍后再检测也不能完全避免上述情况的发生，因此一般不用腹水型单抗作为被检样品。材料：

a.小鼠IgG及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。b.0.06mol/L巴比妥钠-盐酸缓冲液（PH8.6）。

c.1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖加入100ml0.06ml/LPH8.6巴比妥钠-盐酸缓冲液中，隔水煮沸溶解，加0.02%NaN3防腐，4℃保存备用。

d.洁净载玻片，打孔器（直径3mm），湿盒，酒精灯。方法：

a.杂交瘤细胞培养上清液的浓缩：取该上清液10ml装入透析袋中，用线扎紧，放在小烧杯中，透析袋周围堆置PEG6000或蔗糖或PVP（聚乙烯吡咯烷酮polyvinylpyrrolidone），放于4℃数小时，待透析袋内液体量浓缩至约0.5-1ml时，吸出，可于-20℃保存备用；也可采用吹风蒸发浓缩。

b.加热溶化1%琼脂糖凝胶，铺制琼脂糖板，每片约3ml。

c.待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打出梅花形的小孔（中央1孔，周围6孔），然后封底。d.向中央孔加入抗小鼠IgG类或亚类抗血清，周围孔加入待检样品；加样后将琼脂板放入湿盒，置37℃水浴箱中12-24小时或4℃过夜，观察结果。（B）ELISA法

该法不需要将样品浓缩，而且比免疫扩散法更快地得到结果。

材料：

a.ELISA所需用溶液同杂交瘤细胞的筛选一节。b.酶标板。

c.山羊抗鼠Ig；兔抗小鼠Ig类及亚类特异性血清；HRP结合的山羊抗兔Ig等。d.待检杂交瘤细胞培养上清；阴性、阳性对照样品。方法一：

a.每孔加入适量的100ul山羊抗小鼠Ig，室温2小时；洗涤液洗2次。b.每孔加200ul封闭液，室温作用1小时。

c.洗涤液洗2次；加100ul杂交瘤细胞培养上清，4℃过夜；设阴性、阳性对照孔。d.洗涤4次，每孔加100ul兔抗小鼠Ig类及亚类特异性抗血清，室温2小时。e.洗涤4次，加100ulHRP标记的山羊抗兔Ig；室温作用2小时。f.洗涤后，加底物显色，判读结果。

g.若有HRP标记的抗小鼠Ig类及亚类试剂，则可省去e。方法二：

a.以适宜浓度的抗原包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜。

b.洗涤后，加入待检的单抗样品，100ul/孔，37℃1小时；设阴性、阳性对照孔。

c.洗涤后，加入HRP标记的抗小鼠类及亚类Ig的抗体试剂，100ul/孔，37℃避光显色15分钟；用2mol/LH2SO4终止反应后，阅读各孔的OD490值。C、单抗纯度的鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳（IEF）及免疫转印分析（WB）等方法都可用于鉴定单抗的纯度。PAGE、SDS-PAGE、IEF、WB的原理和方法请参阅有关专著，这里不再赘述。⑵单抗理化特性的鉴定

从实用意义上说，单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目，它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。其中单抗亲合力测定比较复杂，下面作简要介绍。

抗体亲合力是指抗体与抗原或半抗原结合的强度，其高低主要是由抗体和抗原分子的大小、抗体分子结合簇（部）和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的。亲合力通常以平均内在结合常数（K）表示。单抗亲合力测定是十分重要的，它可为正确选择不同用途的单抗提供依据。在建立各种检测方法时，应选用高亲合力的单抗，以提高敏感性和特异性，并可节省试剂。而在亲和层析时，应选用亲合力适中的单抗作为免疫吸附剂，因为亲合力过低不易吸附，亲合力过高不易洗脱。精确测定单抗的亲合力是较困难的，好在实际应用中选择单抗时，通常只需测定各单抗的相对亲合力及其高低排列次序。常用的方法有竞争ELISA、非竞争性ELISA、间接ELISA、间接法夹心ELISA等，这里仅介绍竞争性ELISA测定单抗亲和常数的方法。其步骤是：取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜。洗涤后，加入封闭液（0.5%BSA-PBS，PH7.2）100ul/孔，37℃1小时。取一定浓度的单抗，与系列倍比稀释的抗原混合，4℃过夜，使反应达到平衡；必须注意所用抗原浓度至少要比抗体浓度高10倍以上。将平衡后的抗原抗体复合物加入酶标板孔中，100ul/孔，37℃1小时。洗涤后，加入适宜稀释度的HRP标记抗小鼠IgG抗体，100ul/孔，37℃1小时。洗涤后，加入底物（OPD）溶液，100ul/孔，37℃显色15分钟；2mol/LH2SO4终止反应后，于495nm波长测定各孔的吸收率（A）。按下列公式计算各单抗的亲和常数（K）：A0/（A0-A）=1K/a0

其中A0=无抗原时A值；A=采用不同浓度抗原时的A值；a0=抗原总量；K=亲和常数。⑶单抗与相应抗原的反应性测定

单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位，确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置，是单抗特性鉴定的关键环节，同时，进一步分析这类表位的差别，可正确评价单抗的特异性和交叉反应性，如一些抗原为同属不同血清型共有，甚至是科内不同属所共有，而另一些抗原表位则是某种血清型乃至某一菌株或毒株所特有。此外，单抗的反应性往往呈现一种或几种免疫试验特异性，这在建株时予以测定，有利于正确使用这些单抗。单抗反应性测定的方法很多，包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等，选择何种方法依据不同的单抗特性和试验目的而定，请参阅有关论著的详细论述。三、单克隆抗体的生产

获得稳定的杂交瘤细胞系后，即可根据需要大量生产单抗，以用于不同目的。

1、单抗的大规模制备

目前大量制备单抗的方法主要有两大系统，一是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用；另一是体外培养法。

（1）动物体内生产单抗的方法

迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单抗的方法，鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选BALB/c小鼠。本方法即将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单抗且抗体浓度很高。可见该法操作简便、经济，不过，腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险，故而最好用SPF级小鼠。

A、材料：

a.成年BALB/c小鼠。

b.降植烷（Pristane）或液体石蜡。c.处于对数生长期的杂交瘤细胞。B、方法：

a.腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml。

b.7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2ml。c.间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2-3次，通常每只小鼠可采5-10ml腹水；d.将腹水离心（2000r/min5分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用，或冻干保存。（2）体外培养生产单抗的方法

总体上讲，杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖细胞（anchoragedependentcell，ADC），因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10-15%小牛血清的培养基培养，细胞浓度以1×106-2×106/ml为佳，然后收集培养上清，其中单抗含量约10-50ug/ml。显然，这种方法制备的单抗量极为有限，无疑是不适用于单抗的大规模生产。要想在体外大量制备单抗，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单抗的浓度就越高，产量就越大。

目前在杂交瘤细胞的大量培养中，主要有两种类型的培养系统。其一是悬浮培养系统，采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体；其二是细胞固定化培养系统，包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。

A.悬浮培养法：目前小规模悬浮培养多采用转瓶培养，通过搅拌使细胞呈悬浮状态；而大规模悬浮培养多采用发酵式的生物反应器，美国、加拿大、法国和德国等几家公司生产这类反应器，其培养方式可分为纯批式、流加式、半连续式和连续式。

B.微载体培养法：微载体（Microcarrier）是以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，在搅拌作用下微载体悬浮于培养液中，细胞则在固体颗粒表面生长成单层。可用作细胞大量培养的微

载体主要以交联琼脂糖或葡聚糖、聚苯乙烯、玻璃等作为基质的产品，其中以CytodexI，Biosilon和Superbeads为好。微载体培养的基本方法上与悬浮培养相同。近来的研究表明，该法是杂交瘤细胞大量培养的理想途径之一。

C.中空纤维细胞培养系统：该系统由中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵等组成。用于细胞培养的中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯-丙烯复合物、多聚碳酸硅等材料制成，外径一般为100-500um，壁厚25-75um，壁呈海绵状，上面有许多微孔。中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，其孔径只允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单抗等）有滞留作用。目前使用的中空纤维生物反应器分为柱式、板框式和中心灌流式。尽管该培养系统在大规模生产单抗时成本较低，并可获得高产量高纯度的抗体，由于设备价格昂贵，限制了其使用范围。

D.微囊化细胞培养系统：该系统是先将杂交瘤细胞微囊化，然后将此具有半透膜的微囊置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开囊膜，离心后即可获得高浓度的单抗。

总之，上述四种体外培养生产单抗的方法仍处在发展之中；随着研究的不断深入和技术的完善，它们将会在单抗生产的产业化进程中发挥越来越大的作用。（3）杂交瘤细胞的无血清培养

杂交瘤细胞的体外培养绝大多数应用DMEM或RPMI-1640为基础培养基，添加10-20%胎牛或新生小牛血清。基础培养基主要提供各种氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐、各种合成核酸和脂质的前体物质。而血清主要供给杂交瘤细胞等各种营养成分，血清中的激素可刺激细胞生长，其中的许多蛋白质能结合有毒性的离子和热源质而起解毒作用，同时这些蛋白质对激素、维生素和脂类有稳定和调节作用。但是，血清中含有上百种的蛋白质，这给单抗的纯化带来很大麻烦，而未纯化的含有异种蛋白的单抗用于动物治疗可诱发变态反应；加之，血清来源有限；每批血清之间质量差异较大，直接影响结果的稳定性，同时血清是杂交瘤细胞发生支原体污染的最主要来源之一，而且价格较贵，为了克服血清的这些缺点，采用无血清培养基培养杂交瘤细胞越来越受到广泛重视。

无血清培养的实质就是用各种不同的添加剂来代替血清，然后进行杂交瘤细胞的培养。目前已报道的各类无血清培养基有含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白的、含有血清低分子量成分的无血清培养基，其中一部分已有产品出售。综合这些无血清培养基，约有几十种不同的添加剂可用于无血清培养基，在其中至少必须添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠这四种成分，才能起到类似血清的作用，其他较重要的添加剂包括白蛋白、亚油酸和油酸、抗坏血酸以及锰等一些微量元素。

采用无血清培养基培养杂交瘤细胞制备单抗，有利于单抗的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响了单抗的产量；同时无血清培养基还缺少血清中保护细胞免受环境中蛋白酶损伤的抑制因子等。尽管如此，无血清培养基终究会成为杂交瘤细胞培养的理想的培养基。

2、单抗的纯化

（1）腹水型单抗的纯化

在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。

A.二氧化硅吸附法：新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2，0.3mmol/LCa2）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。

B.过滤离心法：用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。

C.混合法：即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。（2）单抗的粗提A、硫酸铵沉淀法

a.饱和硫酸铵溶液的配制：500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol/LNaOH调PH至7.8。

b.盐析：吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5mlPBS（0.01mol/LPH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。

c.脱盐：常用柱层析或透析法。柱层析法是将盐析样品过SephadexG-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2%NaHCO3，1mmol/LEDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/LEDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50-100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12-24小时，其间更换5次透析液，用萘氏试剂（碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20%NaOH50ml）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。a.蛋白质含量的测定：

（Pr）（mg/ml）=（1.45×OD280-0.74×OD260）×稀释倍数；或（Pr）=OD280×稀释倍数/1.3b.分装冻存备用。B、辛酸-硫酸铵沉淀法

该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水加2份0.06mol/LPH5.0醋酸缓冲液，用1mol/LHCl调PH至4.8；按每毫升稀释腹水加11ul辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30分钟内加完，4℃静置2小时，取出15000g离心30分钟，弃沉淀；上清经尼龙筛过滤（125um），加

入1/10体积的0.01mol/LPBS，用1mol/LNaOH调PH至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵至45%饱和度，作用30分钟，静置1小时；10000g离心30分钟，弃上清；沉淀溶于适量PBS（含137mmol/LNaCl，2.6mol/LKCl，0.2mmol/LEDTA）中，对50-100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换水3次以上；取出10000g离心30分钟，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冻存备用。

C、优球蛋白沉淀法

该法适用于IgG3和IgM型单抗的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单抗的回收率高于90%，对IgM单抗的回收率为40-90%不等。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol/L和25mmol/L，随之可见纤维蛋白的产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃8-15小时（若是IgG3单抗，也可室温2小时），其间换水1-2次；取出后22000g离心30分钟，弃上清；将沉淀溶于PH8.01mol/LNaCl，0.1mol/LTris-HCl溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5-10mg/ml，分装冻存备用。

⑶单抗纯化的方法

单抗纯化的方法有很多种，应根据具体单抗的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱、凝胶过滤法和亲和层析法三种。3、单抗的标记

目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂（盒）的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面将介绍最常用的几种标记技术。（1）酶标记

A、辣根过氧化物酶（HRP）标记

辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。程序一：

a.将5mgHRP溶于0.5ml0.1mol/LNaHCO3溶液中；加0.5ml10mmol/LNaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。b.加0.75ml0.1mol/LNa2CO3混匀。

c.加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等（15mg/ml），混匀。

d.称取SephadexG25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交

联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。

e.用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20VNaBH4溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。f.将交联物过SephadexG200或Sepharose6B（2.6×50cm）层析纯化，分管收集第一峰。g.酶结合物质量鉴定：克分子比值测定

酶量（mg/ml）=OD403×0.4

IgG量（mg/ml）=（OD280-OD403×0.3）×0.62

克分子比值（E/P）=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9；OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。标记率=OD403/OD280

酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。

h.HRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装-20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60%甘油4℃保存；不宜加NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。程序二：

1.将5mgHRP溶于0.3mol/LPH8.1NaHCO3溶液中，加入1%二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温搅拌作用1小时，以封闭HRP分子上的α和ε氨基。

2.再加1ml0.06mol/L过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30分钟，溶液呈黄绿色；随后加1ml0.06mol/L乙二醇，轻搅1小时，中止氧化反应。

3.移入透析袋中，在1000ml0.01mol/LPH9.5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。

4.吸取上述醛化好的HRP溶液3ml，加入5mgIgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温轻搅2-3小时，避光；加入5mgNaBH4，4℃放置3小时或过夜，或换用乙醇胺（2mol/LPH9.5）0.2ml，作用7小时。

5.再移入透析袋中，在0.02mol/LPH7.4PBS中透析24小时，更换三次缓冲液。

6.用3000r/min离心30分钟，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。7.8.步骤同程序一。B、碱性磷酸酶（AP）标记

碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：

1.将5mgAP加入1ml抗体溶液（2mg/ml）中溶解，装入透析袋，于4℃对0.01mol/LPH7.2PBS透析18小时，换液三次。

2.加入2.5%戊二醛20ul，室温作用1-2小时，4℃对PBS透析过夜，其间换液三次。3.换用0.05mol/LPH8.0Tris-HCl缓冲液透析，4℃过夜，换液三次。

4.取出标记抗体，用含1%BSA的Tris-HCl缓冲液稀释至4ml，即为AP标记物原液。5.每毫升中加入0.4ml甘油，小量分装，保存备用。C、PAP、APAAP的制备

PAP（过氧化物酶-抗过氧化物酶桥联酶标技术）、APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶标技术）的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调PH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。

根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。（2）荧光素标记

A、异硫氰酸荧光素（FITC）标记

FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：

a.以碳酸盐缓冲液（PH9.3，Na2CO38.6g，NaHCO317.3g，蒸馏水1000ml）调整抗体浓度至10mg/ml。

b.取5ml抗体溶液置于10ml小烧杯中。

c.称取1mgFITC溶于0.2mlDMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作用2小时。

d.将交联物经SephadexG25或G50柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。

e.FITC的结合物质量鉴定

IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4

F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般说，FITC对抗体的摩尔比为3：1时适合于组织切片染色，为5-6：1时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。

f.标记抗体的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。

B、异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记:基本与FITC标记相同。（3）同位素标记

必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。正常情况下应包括避免物理的接触和对γ-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。A、碘标记

用碘标记抗体是一种有效的标记方法。125I衰变产生低能的γ和Χ射线，很容易被检测出来，而其60天的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。最常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入到抗体和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化成I2，游离I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下：

a.在进行标记之前，先选用截流分子量为20000-50000的凝胶，制备1ml凝胶柱，然后分别用10倍体积的1%BSA/PBS/0.02%叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。

b.加入10ug纯化单抗至含有25ul2.5mol/L磷酸钠（PH7.5）的1.5ml指形管内。随后，加入500uCiNa125I混匀。

c.加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室温放置60秒。再加入50ul氯胺T终止液（含2.4mg/ml偏重亚硫酸钠，10mg/ml酪氨酸，10%甘油和0.1%环乙烷酰二甲苯的PBS）。

d.将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1.5ml指形管收集。当碘标记物全部进入柱体，加入0.3ml含0.03%叠氮钠的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml0.03%NaN3PBS，下口收集0.3ml，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体大约在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。e.将标记单抗保存于4℃可使用6周时间。B、生物合成法标记

将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位素会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。其主要步骤是：a.离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，约需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。

b.用含2%PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个/ml，加入35S甲硫氨酸（每次加入100uCi可产生105-106cpm的抗体）。c.经C02培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清，分别加入1/20体积的1mol/LTris（PH8.0）及叠氮钠至浓度0.02%。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。（4）生物素标记

生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是：

a.用二甲基亚砜配制10mg/ml的N-羟琥珀酰亚胺生物素（应根据需要选用不同大小和间臂长的生物素化琥珀酰酯）。b.用硼酸钠缓冲液（0.1mol/L，PH8.0）稀释单抗溶液至1-3mg/ml。c.每毫克抗体加入25-250ug的生物素酯，混匀后，室温作用4小时。e.按每250ug生物素酯加入20ul1mol/LNH4Cl终止反应，室温放置10分钟。f.以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。（5）他标记技术

适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如金标记、化学发光标记、SPA标记、铁

蛋白标记等。

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide,MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。MTT步骤如下：

1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.

2:培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3：呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配)20ul.

继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ulDMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项：

（1）选择适当得细胞接种浓度。

（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入计算公式：Pm=0.95Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025

有一个公式可供参考;

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)Xm:lg最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率Pn:最小阳性反应率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

例：

用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ulDMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值