2016级研究生细胞生物学实验讲义

内容：

1.小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养 2.细胞计数

实验所需（每组）：

小鼠3只，75%酒精1瓶，大烧杯一个，饭盒1个（内有：大剪刀1把，大镊子1个，眼科剪刀2把，眼科镊子2把），一次性培养皿2个，PBS液（含双抗）50ml，DF12培养基（含15%血清）10ml，15ml离心管1个，5ml注射器1个，移液器一套（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10ul），血细胞计数板1个，计数板专用盖玻片2个，燃烧酒精0.2L。 实验方法：

1、高压消毒取材用器材：剪刀（包括眼科剪）数把、镊子（包括眼科镊子）数把。 2、断颈处死小鼠，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，在含PBS的平皿中去除股骨周围肌肉组织，剪去包括骺板在内的两侧骺端，暴露骨髓腔。

3、用5ml注射器以PBS反复冲洗骨髓腔直至发白，反复吹打骨髓细胞悬液，制成单细胞悬液，1000rpm离心10分钟。

4、弃上清，适量培养基重悬，细胞计数，种植密度为1-2x106/ml于25cm2培养瓶，将培养瓶放于370C，5%CO2孵箱进行培养，此即为0代。48小时后观察换液。待细胞呈80-90%汇合时，进行消化传代。

二、细胞的浸润与转移：

内容： 1.划痕实验 2.transwell实验 实验所需（每组）：

贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞，细胞浸润实验24孔板专用的transwell（孔径6-8um、单个装），灭菌0.1%明胶1ml，24孔板1个，PBS液（含双抗）50ml，0.25%胰酶10ml，肿瘤细胞培养基20ml，血清3ml，15ml离心管2个，移液器一套

（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10ul），燃烧酒精0.2L，棉棒1包，结晶紫染液1ml。 实验方法： 1.划痕实验

用无菌200ul tip头在培养有肿瘤细胞的24孔板中轻轻划一道直线（划掉细胞为准），更换无血清培养基，培养24小时后观察。 2. transwell实验

1）提前将transwell用0.1%明胶包被。

2）将具有侵袭能力的肿瘤细胞胰酶消化，无血清培养液重悬。

3）24孔板每孔下室中加入含10% 血清（作为趋化剂）的培养液；上室中立即

加入无血清培养液重悬的细胞悬液。

4）将24孔板放入培养箱中常规培养。24小时后以无菌棉棒轻轻揩去上室残留细胞后，用4%的多聚甲醛固定上室底面的细胞，室温放置10min。蒸馏水洗涤。

5）蒸馏水洗去固定液后，结晶紫染色10 min。蒸馏水冲洗后观察。

三、细胞转染

内容：

miRNA的细胞转染

实验所需（每组）：联系好荧光显微镜。

荧光标记的miRNA、脂质体2000、贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞，灭菌1.5ml EP管，PBS液（含双抗）50ml，无血清无抗生素转染专用Opti-MEM 培养液5ml，移液器一套（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10ul），燃烧酒精0.2L。

实验方法：（按照每孔计算）

1.用无血清无抗生素转染专用Opti-MEM 培养液250 ul分别稀释2 ul miRNA和1ul转染试剂（脂质体2000）。轻轻混匀后室温孵育5min。

2. 将脂质体2000稀释液缓慢逐滴加入待转染的miRNAs稀释液中，轻轻混匀。混合液室温孵育20min。

3.从培养箱取出待转染细胞，吸弃培养液，用PBS液洗一遍。吸净洗液后每孔缓慢逐滴加入孵育好的miRNA-脂质体2000复合液。

4. 转染6h后，吸弃转染工作液，用PBS液洗去未转入的miRNA-脂质体2000复合物，更换相应培养液，荧光显微镜观察。

四、细胞凋亡

内容：

Annexin V/PI 双染检测肿瘤细胞的凋亡。 实验所需（每组）：

Annexin V/PI 双染试剂盒，贴壁培养在24孔板中的肿瘤细胞，双氧水，灭菌1.5ml EP管，PBS液50ml，移液器一套（1000ul、200ul、10ul），灭菌Tip头一套（1000ul、200ul、10ul），燃烧酒精0.2L。 实验方法：

1.终浓度为500umol/L 的双氧水加入到培养液中处理肿瘤细胞5min。 2.PBS 洗涤细胞两次。

3.用500ul 1X Binding Buffer 中加入5ul Annexin V-FITC和5ul PI，混匀。 4.将上述溶液加入细胞中，均匀覆盖细胞表面。 5.避光条件下室温孵育5-15 分钟。 6.在1 小时内检测。

用双氧水刺激肿瘤细胞，一般情况下，终浓度为200umol/L 的双氧水作用5分钟就可以出现凋亡。

3%双氧水是0.8824mol/L 所以是4000X的。