烟台大学林剑主讲课程
第一章 绪论
§1-1发酵工艺学的基本概念
一、发酵工业的基本概念
微生物学中的发酵的定义：微生物发酵工业的概念： 1.发酵工业生产的基本模式
讲述生物工业的基本生产模式，引出生物技术、生物工程的概念，讲述两者之间的区别与联系 2.发酵工业的分类
酿酒业（啤酒、葡萄酒、白酒……）。
厌氧发酵 调味品（酱油、醋）。
酵母工业——自然发酵。
氨基酸发酵——典型的代谢控制发酵。 抗菌素发酵——次级代谢控制发酵。 酶制剂工业——具有重要的意义，是工业发展 的基础、科学研究的基础
有机酸工业—柠檬酸、葡萄酸、乳酸、琥珀酸等。
石油发酵——降低石油熔点（石油脱腊） 有机溶剂工业——乙醇、丙醇等
好氧发酵 维生素发酵——VC、VB2
生理活性物质——白介——2
环境工业——废水的生物处理，废弃
物的生物降解
二、微生物发酵的基本特征
1.微生物发酵过程是一个典型的化工过程
由于微生物生理特性决定了微生物在发酵过程中需要稳定的环境、特殊的条件以及以氧作为底物的供给，这些多涉及到化工生产的一下领域：
（1） 质量的传递——氧的供给、代谢物的排泄等
（2） 热量的传递——微生物呼吸产热，微生物生长于代谢需要
稳定的而严格的温度条件。
（3） 动量的传递——涉及到搅拌轴功率的计算，他与溶氧、气
液混合的关系
（4） 微生物的反应工程——涉及到微生物的生长动力学模型
的建立，产物生成动力学模型的建立。
2.微生物发酵过程是一个典型的代谢控制发酵
从微生物发酵的历史角度看，最早的微生物发酵是一个自然发酵过程，现代微生物工业通常是指微生物的代谢控制发酵？
定义：是指利用生物的、物里的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。
以GA发酵为例，建树微生物代谢控制发酵的意义。
3.微生物发酵工业又是一个有别于化工过程的一个工业 有以下几个特征：
（1） 反应条件温和 通常由于微生物的生理特性，要求温度为
30℃-40℃ pH值中性偏酸性——酵母、霉菌、放线菌等，pH值中性偏碱性——细菌的发酵
（2） 无菌发酵 整个反应过程要求无菌：培养基无菌、空气无菌、
补料和取样要求无菌操作、某些工程菌，其尾气也要求进行无菌处理。
（3） 非连续性生产 微生物的生理特性决定了发酵过程的非连
续性大部分的工业发酵是以间歇操作为基础进行的，目前可以实现连续化生产的是：啤酒的连续化生产……
§1-2微生物工业发酵的历史及发展方向
一、 微生物工业发酵的历史
微生物发酵有着悠久的历史，几千年前的酿造实质上就是一个典型的微生物发酵过程， 近几十年的来微生物发酵不但在应用领域上更加广泛，
更重要的是建立了许多新的微生物发酵理论体系，诸如：代谢控制发酵、基因工程菌发酵等……微生物发酵的发展可以分为以下几个阶段：
二、微生物发酵工业的发展方向
微生物发酵工业有着悠久的历史，在国名经济中占有重要的地位，21世纪又是生物的，体现在哪里？
1. 从工业领域看
微生物发酵将占据越来越重要的地位，具体的讲： （1） 通过生物工程解决能源问题
能源问题是全球面临的问题，生物工程如何解决？
太阳能 淀粉、纤维素 酶工程 G 发酵 乙醇 能源
乙 烯
（目前已取得突破性进展）
生物工程作为桥梁，2000年世界产值已达50亿美元 （2） 取代部分化工工业
许多化工产品的生产由于严重的污染和生产效率问题，而为生物工程取代，例如：乙醇、甘油、乳酸等
（3）农业：生物农业、农产品加工等方面 （4）医药： 2.从产品角度看，应围绕下列领域：
（1）酶制剂工业：即是生产工具，又是科学研究的工具和基础 （2）新型抗菌素工业和维生素行业 （3）氨基酸及多肽发
酵 (4)生物免疫物质：白介素-2、干扰素、抗肿瘤物质等 （5）细胞工程及疫苗 3.从科学技术角度看
（1） 底物基质的转变 以葡萄糖为底物的发酵转变为以更
为广泛的基质为原料，特别是以废弃物为基质的发酵，废弃物资源化是其发展方向。
（2） 开发新产品 利用现代生物技术为基础，开发新产品，新
的产品层出不穷，使得微生物发酵向国民经济的各个角落渗透。
（3） 微生物发酵向着大型化、自动化、连续化的方向发展。
英国帝国化学公司，甲烷菌发酵罐的容积已达到3000m2
本课程的内容和任务
本课程是生物工程专业本科生的专业基础必修课程，是一门以微生物、生物化学、化工原理等课程为基础，以微生物发酵过程中各种单元操作为主线条，对微生物发酵过程中的基本原理进行阐述的课程。
其基本内容如下：
1. 发酵生产用菌种及其有关知识
包括
菌种选育 菌种保藏
生产过程中菌种的扩大培养
2. 培养基的制备及灭菌
包括：工业发酵用原料的选择与处理 培养基的灭菌原理和方法 工业灭菌的工程计算
3. 发酵机制 包括：乙醇、甘油、谷氨酸、柠檬酸、赖氨酸、抗生素等
4. 发酵过程及控制
包括：温度的变化及控制 pH值的变化及控制 氧传递动力学 泡沫的消长规律及控制
思考题：
能源问题是全球面临的问题，生物工程将如何解决？写出一遍综述。
第二章 微生物发酵用菌种及其扩大培养
§2-1微生物发酵工业用菌种
一、微生物发酵工业用菌种的特点及要求
微生物发酵工业用菌种因不同的发酵对其要求各异，就是同
一种产品的发酵生产，其菌种的特点和要求因不同的原料和生产设备的不同也有很大差异，例如：GA 的发酵： 以淀粉质为原料：要求VH-,
以糖蜜为原料：因为糖蜜本身含有非常丰富的VH…… 但是作为工业微生物发酵使用的菌种，通常有下列特点： 1.具有稳定的遗传学特性
这对于工业化生产是很重要的，通常工业化生产整个周期很长，在一个发周期中，菌体至少应该增殖一次，在增殖过程中，菌体应该保证原菌的遗传学特征，（尽管菌体生长的环境改变了，压力、基质、溶氧等）
2.微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求
换言之，可以广泛的使用各种原料作为生产用的底物，某些微生物对于底物有着严格的要求，对于碳源要求单一，这对于微生物的发酵工业提出了严格的要求，增加了生产成本。
3.生长条件易于满足
在微生物的工业化生产过程中，某些环境条件很难实现。氧的传递和供给就是一个很难完全满足的条件，特别是对于高粘度、高浓度的发酵体系。
对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子，这个溶氧浓度越高，说明菌体生长条件越易满足，从另一种意义上讲，工业化的生产成本就越低。
pH值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物
的状态。
4.对于细菌，希望具有抗Phage的能力。
5.具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率
和反应速度，进而可以缩短发酵周期，降低生产成本。 6.对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗
透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。
对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎； 对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体 内，对于包含体，要求在细胞破碎是不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。
二 微生物发酵工业用菌种的种类
野生型 从菌种的遗传学特征上可以把菌种分为：
培养：营养缺陷型……
从微生物分类学的角度，分为 1. 细菌类： 短杆菌：GA,Gln,lys……
枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) α-Amylase 苏云金芽孢杆菌：BT生物农药…… 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵
2. 酵母菌 啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵 酒精酵母：
汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵 假丝酵母：scp生产，石油发酵
3.霉菌 黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制
剂工业（糖化酶）
黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱 青霉菌：青霉素的生产
红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色
素的生产；豆腐乳的生产等
赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素
4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等
§2-2微生物用菌种的扩大培养
一、菌种扩大培养的目的
1.提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。
目的就是：a、缩短发酵周期
降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的） b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌
的生长。
从对数残留定律上看，任何灭菌过程都不能够做到绝对无菌，抑制杂菌生长除了严格环境以外，在数量上让培养菌占绝对优势也是一种方法，往往是一种行之有效的方法。例如：啤酒的发酵……
2.让菌种从固试管、液体试管……，逐步适应，例如：啤酒发酵
3.菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐现
象。
许多生产菌种往往都是“溶原性”的？
通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，无疑增加了生产的可靠性。 二、扩大培养的方法
通常有两种方法：固体法：用于酿造业（酱油、白酒等），也是源
于酿造业， 有霉菌的纯培养，也有混合培养如：大曲
液体法：液体深层培养，适合于众多发酵行业
1. 液体扩培流程
固体试管 三角瓶 大三角瓶 一级种子 二级种子
三级种子
发酵罐
2. 固体扩培流程
固体试管 三角瓶 种曲 麸曲（机械通风制曲）
两者的优缺点比较： 固体培养
（1）酶活力高。（因为菌丝体密度大） （2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。
（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易
于分离，可以有效的降低产品分离成本。 缺点：
（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。 （2）周期长。
（3）培养过程中环境条件控制较难。
（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。 液体培养
（1）生产效率高，便于自动化管理。
（2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面控制。 （3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。 缺点：
（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。
（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而
难以实现。
现代生物技术的发展是以基因工程菌为主导的微生物发酵领域，其菌种的培养要求无菌程度高，而且培养过程中的条件要求也非常严格（否则易发生变异导致质粒丢失），从这种意义上讲，固体菌种的制备是难以实现的，因此，应以液体培养为主导方式。
应该指出的是：
随着生物工程与技术的发展，许多传统的应用微生物工业的菌种已形成了产业化。例如：酒精的生产 原生产工艺流程为：……
其中以酵母为线条的生产工艺为： 以霉菌为线条的生产工艺为：
现在：（1）酵母使用粉末酵母 鲜压榨酵母 固定化酵母细胞
（2）霉菌则由各种液化、糖化酶取代 三、菌种扩大培养的条件：
菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。但是，与发酵工艺却有着很大的差别。 1.培养基：
种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。
例如：啤酒酵母扩大培养用的培养基组成如下： 固体试管 液体试管 三角瓶 大三角 （无酒花） （有酒花） （有酒花）
汉逊罐
通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。 例如：HASS（高温淀粉酶） 三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖 3m3种子罐：液化淀粉 2.温度
种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。 例如：啤酒酵母扩大培养
固体 液体 三角瓶 大三角瓶 汉逊罐 28℃ 25℃ 20℃ 15℃ 10-15℃ 需要指出的是：
（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30℃，而产物合成温度为32-34℃
（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。 3.氧的供给
菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。
足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等，后述。 4.pH值
菌种扩大培养的pH值很重要，直接影响到菌体的正常生长，
需要注意以下两点：
（1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往往与发酵最适pH值不同。
（2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5——1.0个单位，因
此，……
（三角瓶灭菌后，不能够调整pH值，不宜无菌操作）
思考题：
1.比较固体培养与液体培养的优缺点。 2.说明菌种扩大培养的条件。
3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？ 4.工业生产用菌种的基本要求有什么？
第三章 微生物用培养基及灭菌
本章的主要内容： 1.培养基的制备2.starch 的水解3.培养基的灭菌
§3-1培养基的制备及要求
一、培养基用原材料及要求
微生物发酵领域其本质，也可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物，在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的：（1）产物的社会效益， （2）物质转变过程中产生的经济效益，即：低价值的原材料、低能耗等
对于特定的已知产物，在选择培养基原料时，则应注意以下几个原则：
1、培养基原材料的要求
（1）价格低廉，易得到（价格低，但不一定易得到，例如：地
瓜干）
（2）对微生物的生长繁殖和代谢无抑制作用的物质 （3）微生物的代谢产物无有害物质。 2、培养基用原材料的种类 碳源 starch 及其水解糖液
含有starch 及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝
生产废水等
化工石油产品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等
氨水、尿素（有脲酶的微生物），以流加形式使用
(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL等
氮源 豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、 菌体蛋白？、 玉米蛋白粉等
二、培养基的种类 固体发酵 生产培养基 厌氧发酵 需氧发酵 按用途可分为：种子培养基
摇瓶培养基（优化工艺……）
检查培养基：HASS发酵用的检查培养基： 营养琼脂0.5%—0.55%、Sarch 2%，
Glucose 0.5%
平板培养，根据透明圈的大小 本章涉及到的培养基为：生产使用的培养基 三、培养基的制备 1.培养基配制的原则
培养基制备是发酵成功与否的第一个要点，制备一个完整而科学的培养基是很重要的，也是非常艰巨的任务。通常制备培养基需要考虑以下几个方面的问题： （1）合适的C/N，
不同的微生物、同一种微生物不同的菌株，其对培养基中的C/N要求是不一样的，同一菌株在不同的发酵阶段，其对C/N的要
求也不一样。
例如：黄源胶（Xanthan Gum发酵）：前期，较低的C/N，目的是强化菌体的生长和增殖：但是，在黄源胶的生物合成期，则需要较高的C/N，假如在这一时期，培养基中氮源仍然很高，其导致的发酵结果是，底物消耗了但产物的产率却很低。
在大多数情况下，C/N要求在0.2——2.0。对于一些特殊的情况，例如谷氨酸发酵，在谷氨酸生物合成期，则要求C/N为：100/15-21。
（2）在确定了C/N的前提下，需要研究的是不同的氮源，对发酵的影响。
虽然C/N确定，但是氮源的利用其本质就是：pr 肽 AA,通过AA而被利用，不同的氮源，其AA的组成与比例也不相同，对其发酵结果的影响也不相同。有人在HASS(高温淀粉酶)的发酵过程中，向培养基中添加某些AA（亮，异亮）则有利于高温淀粉酶的合成基因的表达，发酵液中的酶活力则明显得到提高。 （3）大多数的工业培养基都使用玉米浆。
玉米浆内含有VH，它是菌体生长和代谢的所必需的一种辅酶，通常玉米浆与：
a. 菌体的增殖速度有关
b. 与菌体细胞膜的合成有关，从而影响到细胞膜的通透性 c. 对于某些菌体，与代谢途径和代谢机制有关。 （4）生长因子：
大多数菌体的生长因子如下：
a. 维生素：大多数维生素是微生物生长的辅酶，需要量很小，1—50µg/L。
b. AA，凡是微生物自身不能合成的AA则必须以游离的AA或者小分子的肽提供，通常，以小分子的肽提供，微生物更易
通过细胞膜进入菌体内部 ?，如果提供外援氨基酸，需要注意的是各种氨基酸的平衡。 c. 嘌呤及其衍生物 2.培养基的优化方法
一种合成培养基的设计，需要考虑的因素是很多的，需要研究的成分也是很复杂的，其中包括碳源、氮源、玉米浆等，即便是碳源还可以是几种碳源的混合体，再加上述几种因素之间的相互影响，要确定一个科学的培养基配方是需要做大量的工作的，采用一个合理的数学方法，就可以在减少工作量的前提下，得到科学的结果。
介绍一种数学方法：均匀实验设计方法——旋转正交实验方法. 这是在正交实验的基础上发展起来的一种对于多因素、多水平的一种实验设计方法。
参考文献：方开泰:均匀正交实验方法 雄宗贵:发酵工艺学原理
§3-2培养基用材料及处理
一、淀粉的水解
许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使Glucose等单糖，主要有下列菌种：
酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等
大部分的细菌：GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等
其中：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以
淀粉为原料。
霉菌：大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具
有淀粉的水解能力。
淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶
法、酶酸法，分别介绍如下：
1.淀粉的水解方法 （1）淀粉的酸法水解 水解原理：
淀粉是由葡萄糖通过α-1，4或α-1，6葡萄糖苷健连接而成的含有多个葡萄糖的大分子长链物质，根据其葡萄糖连接的糖苷健的不同，可分为枝链淀粉和直练淀粉，可以使用重合度 来表示淀粉分子的大小，所含有的葡萄糖苷健的数量，称之为淀粉的重合度，用DP来表示。淀粉内部的葡萄糖苷健在一定的温度和酸性的条件下可以水解，而使淀粉分子链断裂，高温可加速葡萄糖苷健的水解速度。
水解条件：高温，120℃以上， H, 0.2MPa 的压力
+
缺点：反应条件比较强烈，产生的副产物较多.
主要有下列副产物：
a. 双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖，
前者不利于产物的结晶提出，后者对于菌体的生长有抑制作用。
b. 一分子葡萄糖脱水，形成5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。
c. 一分子葡萄糖和—NH2反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。(美拉得反应)
2.酸酶法 3.酶酸法
4.双酶法：使用两种淀粉水解酶：α-淀粉酶
淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶。
α-淀粉酶 ：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉α-1，4葡萄
糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，液化的含义？其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖（从水解葡萄糖苷健的种类，水解速度到最后已无工业意义三个方面），因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。
淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉
分子的α-1，4；或α-1，6葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。
酸法与双酶法的优缺点比较：
（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的
生长有利。
有的人会问？目前采用的耐高温α-淀粉酶的作用温度也是
较高，突破100℃，和酸法水解的温度相差不多。双酶法淀粉水解首先使用耐高α-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。
（2）正因为上述原因，淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可
以提高10%以上。这可以给味精、制药的领域带来巨大的经济效益。
例如：对于年产10000吨的小型味精厂，年增产100吨味精，直接经济效益可达到：0.8*100=80万元。
（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条
件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。
（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到20Be以上，
而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有12Be，原因？（副产物）意义？（设备利用率） 介绍液体浓度Be的概念： 波美度（Be）是表示液体浓度（比重）的一种方法，其和液体比重之间有下列关系：
d = λ/λ- Be 式中——d： 液体的比重 λ： 模数 λ因标定的温度不同可将波美表分为：
美国：15.6℃标定，λ=145
合理：15℃标定，λ=144.3
荷兰：12.5℃标定，λ=144 标定方法：
轻表：“0”Be的位置，把表放在一定温度下的蒸馏水中的位置； “10” Be的位置，把表放在一定温度下的比重为0.9351 的溶液中的位置。
重表：“0”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的蒸馏水中； “66”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的比重为
1.842的浓硫酸溶液中。
表示溶液的比重的方法还可以使用Bx(玻利克斯)：
定义：某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为
Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。
注意： Bx的概念不同于波美度，他与比重之间是没有计算公式的，但是可以查找有关换算关系。 2.淀粉的双酶法水解工艺
淀粉调浆 液化 糖化 过滤 糖液 浆液浓度：20—30Be,调pH值6.0—7.0，
添加CaCL2,使用量，0.01mol/L（目的？）
液化：耐高温α-淀粉酶，酶的使用量：5—8单位/g淀粉 温度：105℃；时间，20—30分钟 降温：采用喷射冷却方法：
糖化：使用淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶；
使用量：根据液化淀粉的浓度，30%的浓度，80—100单位/g淀粉 温度：65℃
终点判断： 时间，2—3小时。 二、糖蜜的处理 1.糖蜜的主要成分
（1） 糖，49—50%，因不同的原料和生产方法不同而异，主要
是蔗糖 （2） 胶体物质，5—10%，来自于原料 （3） 灰分，10—12%
（4） 生物素，1—10mg/Kg(甘蔗)，0.04—0.06 mg/Kg(甜菜) （5） pH值6.2(甘蔗)，7.4（甜菜）
对于发酵工业可以利用得的主要成分是：糖和生物素 2.用途
（1） 发酵工业用原料，国内发酵生产的有：味精、酵母
目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染，…… （2） 使用糖蜜生产酒精
（3） 使用糖蜜生产蒸馏酒——姥姆酒，世界名酒，牙买加的国
酒，在西方国家主要用于鸡尾酒的勾兑上。 （4） 作为添加剂使用，柠檬酸发酵，作为添加剂使用。 （5） 使用糖蜜发酵生产黄源胶，已有研究报道。 3.处理方法 处理目的：
a.除去胶体性物质，降低糖蜜的粘度，提高发酵液的流动性， 有 利于改善发酵过程中氧的传递。
b.脱色，除去有色物质（有色物质的来源？），对产品的质量有影响，对微生物的生长和代谢有影响。 c.中和过量的酸碱性物质，除去部分对pH值有影响的缓冲性物
质。
方法：a.冷酸通风沉淀法，即加酸后，通风，使之沉淀
糖蜜经酸化后主要是除去糖蜜中胶体性物质，通风
的目的是除去一些挥发性物质。（教材中提到的通风
是为了提高KLa是错误的）
b.加絮凝剂（PAM）
聚丙烯酰胺（ PAM）作为絮凝剂，可以促进大分子物质的沉降，有利于糖蜜的澄清。
工艺过程：
原溶液（稀释） 40Bx 调pH值(3—3.8) 絮凝 静置 絮凝剂的用量：8mg/L，静置时间：1小时
加热到90℃
C.活性炭吸附法
可以除去糖蜜中的有色物质，明显的降低糖蜜的色泽，对
发酵的产品的提出和产品质量有益。
缺点：活性炭的使用量较大，处理成本较高。 三、工业培养基的添加剂
添加剂通常是指除了培养基中的C、N、无机盐、金属离子以外的其它物质，主要有： 1.前驱物质
特别是对于某些氨基酸、核苷酸和抗菌素的发酵生产，
添加一定量的前驱物质（前体）其作用是非常明显的。 基本原理：
（1）S 前驱物质 产 物
反馈抑制的存在，需要添加前驱物质 不存在抑制或阻遏 （2）S 前驱物质的和成效很低，需要添加前驱物质
（3）S X 前驱物质 产物
存在分枝代谢，不能够很好的解决分枝代谢对X的反馈抑制作用，须要有添加剂
注意：前驱物质的使用，因不同的菌种、不同的产物、不同的代谢机制而使用的方法不同，使用的浓度也不同，但都是建立在对其代谢调节机制有从分的了解的基础上的。 2.代谢促进剂和代谢抑制剂
促进剂主要是指诱导物，在酶的生产；抑制剂主要在抗菌素的生产中使用的较多。
例如：（1）四环素发酵过程中，添加NaBr,可以抑制金霉素的生物
合成，从而提高四环素的产率。
（2）头孢霉素C，添加L—Met，可以抑制头孢霉素N的生
物合成，从而提高头孢霉素C的产率。
上述这些情况，抑制剂对代谢的抑制作用是发生在代谢链具
有分枝代谢上的，如下图所示：
S A B C 产物
副产物（X） 抑制剂作用点，通常是X的结构类似物
§2-3培养基的灭菌
一、灭菌原理
所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，这一概念不同于消毒。后者是指消灭一切致病微生物（病原体） 灭菌的方法很多，在实验室可以使用干热灭菌、对于环境可以使用化学试剂灭菌，但化学试剂的灭菌方法有很大的限制。 在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌 ？
湿热灭菌的显著优点是：使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。
下述内容就是针对湿热灭菌的。 首先讨论几个基本概念：
1.微生物的热阻
定义：微生物的热阻就是指微生物对热的抵抗能力。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。 相对热阻：两种微生物的热阻之比。
例如：芽孢/大肠杆菌=3000000/1；病毒/大肠杆菌=1—5/1等
2.理论灭菌时间
微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程： -dN/dt = k * N
式中——-dN/dt：表示灭菌过程中某瞬间活菌的减少速率 N：表示表示灭菌过程中某瞬间的活菌数 K：表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数，
K=f(灭菌温度、菌种、培养基等)
上式的积分形式为：
t = 2.303/k * lnN0/NS
式中——N0，NS： 分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的
浓度（个/ml）k：意义同上
t ：表示理论灭菌时间 理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题：
（1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同
的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物
热阻的一种表示形式，微生物的热阻 越大，K值也越大。
例如：芽孢，在121℃时，K=60/s
营养体，在121℃，k=60—6*1010/s
(2)在计算过程中，N0，NS如何取值？ N0 = 芽孢性细菌总数 + 芽孢数
灭菌时温度升高，营养体即可变成芽孢
对于 NS ，如果取NS = 0，那么，t = ∞，这显然是与现实情况不符。
对于如何NS取值？通常取NS = 10-3，这个数值如何理解？灭菌1000次，有一次是失败的，残留了一个活菌体。这个数值的取值的大小，也间接反应了该生产过程中的技术管理水平。 （3）上述灭菌时间，通常称之为理论灭菌时间，只可以用于
工程计算中，在实践过程中，因蒸汽的压力问题（不稳定）、蒸汽的流量问题有很大差别，甚至培养基中的固体颗粒的大小、培养基的粘度等因素，都会影响灭菌效果，因此在实际生产中，通常采用经验数值：
间歇灭菌，121℃，20—30分钟
连续灭菌，137℃，15—30s，在维持罐中保温8—20分钟。 3.灭菌温度的选择
灭菌温度的选择应考虑的因素主要有：
a.微生物的热致死温度，应高于该温度。通常以芽孢为
准。何为热致死温度？（10分钟，全部死亡的温度）
b.营养成分的破坏，灭菌的过程实质上也是营养成分破
环的过程 因此，灭菌温度的选择，应是在保证灭菌效果的前提下，尽可能减少培养基中营养成分的破坏。
许多实验研究结果表明，培养基在高温灭菌的过程中，其营
养成分的破坏在很大程度上可以用一级反应来描述其反应速度： dc/dt = - K×C
式中——dc/dt：表示营养成分破环的速率， C：表示营养成分的浓度
，
K：为反应速度常数，1/s，K = f( t,……)
反应速度常数K，与温度的关系，可以使用阿累尼乌斯公式表示之：
K， = A×e
，
[-E/RT]
，
……（1）
式中——K，：反应速度常数，1/S E,：反应的活化能（J/mol） R：气体常数，1.987*4.18 J/mol*k T：反应的绝对温度，k
同样，灭菌过程中的反应速度常数也可以用下式表示出： K = A×exp
[-E/RT]
…… （2）
（1）、（2）式可以改写成下列形式： lg(k
,2
/k1) = E/R×(1/T1 – T2 ) …… （3）
,,
lg(k2/k1) = E/R×(1/T1 – T2 ) …… （4）
（3）（4）的意义是指：反应的温度从
T1 升高到 T2 ，其反应的
,,
速度常数分别从k1 增加到 k2；k1 增加到 k2；
培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应， 如下所示： A C
对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：
B
lg(k2/k1)/lg(k
,2
/ k1)= E / E …… (5)
,,
实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能E的值为 E= 8.36—83.6*103 J/mol 而菌体死亡的活化能E
芽孢：E = 418*103 J/mol E = 无芽孢：E = 209—250*103 J/mol 显然，（5）式的比值 〉1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。通常所说的高温短时 灭菌可以提高生产效益，其理论根据就在于此。
但是高温短时灭菌是需要一定的设备条件的，通常需要连续化的灭菌工艺流程？（高温后的快速冷却在大型的生物反应器内是很难实现的……）这就给中小型生产企业带来了一定的困难，设备投资的增加，技术管理水平的提高（培养基连续灭菌后，后述设备的无菌化管理对于整个体系的无菌操作是必需的……）
,
高温短时灭菌 的优点还可以表现在：节省能量上，培养基的预热？
二、培养基的工业灭菌方法
培养基的工业灭菌通常涉及到以下几个概念： 1.空消:
意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，
对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。
采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。 2.实消：定义？
优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。 3.连消：定义？
优点：营养成分破坏少，生产效率高 热综合利用率高 大型企业自动化程度高
尽管，高温短时灭菌的优点非常明显，但不能说发酵领域采用高温短时灭菌是唯一的选择。一个生产企业灭菌方法的选择是要从生产工艺、设备、操作、技术管理、固定资产投资等多个方面整体考虑。
目前，我国发酵领域仍然是以分批操作的实消为主，因此我
们的后述内容主要是介绍分批操作的实消灭菌工艺。 三、分批灭菌操作要点
将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下： 1. 定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。 2. 培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气？当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道出于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。讲一下，阀门的特殊性？
3. 培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到100℃时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，
另一方面，当培养基的温度升温到100℃时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。
4. 注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。
5. 保温期间，要求罐压：0.09—0.10MPa，温度：118—121℃，时间：30分钟。
6. 灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。 7. 配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。
四、分批灭菌的工程计算
主要介绍一下传热计算（与毕业设计教学环节有关，与将来的实际工作关系更大）。 1.升温阶段
培养基在反应器内的升温有两种加热方式： （1）使用夹套、冷却排管 （2）蒸汽直接加热 （1）使用夹套、冷却排管
t = W*C/ K*F ×ln (t1 – t2s )/( t1 – t2f ) 式中——t：升温所需要的时间（小时） W： 培养基的重量，（Kg） F：总的传热面积，m2
t1：加热蒸汽的温度，℃ t2s：培养基加热的起始温度，℃ t2f：培养基灭菌的温度，℃ k：平均传热系数，KJ/m2*hr*℃
因为在加热过程中，培养基的温度在不断升温，温差在变化，属于不稳定传热过程，其传热系数k，应取平均值： 夹套加热：k = 830—1254 KJ/m*hr*℃ 排管加热：k = 1254—1881 KJ/m2*hr*℃ C：培养基的比热，KJ/Kg*℃ 比热C的计算方法：采用线性叠加法： C = 0.37×4.18*X +4.18×（1-X） 醪液中固形物的重量百分数%
0.37×4.18：固形物的比热，KJ/Kg*℃
任何以谷物、淀粉为原料的醪液，其比热都可以这样计算。
2
（2）蒸汽直接加热
加热的速度很快，时间不需要计算，需要计算的是蒸汽的消耗量：
S =[ W*C((t2f – t2s )+Q1 ]/( λ – t2f ) 式中——S：蒸汽的消耗量，Kg
Q1：发酵罐散失的热量，Q1 = Q总 ×（10——20）% λ：蒸汽的热含，KJ/kg(与蒸汽的压力有关)
t2f、t2s ：与上述相同
2.保温阶段
此时，打开发酵罐顶部的所有排气阀门，排蒸汽灭菌： 蒸汽的消耗量S计算如下： S = 1.19 × F×T×(P/γ)0.5 式中——S：蒸汽的消耗量，Kg F：蒸汽排出口总面积，cm2 T：排气的时间，分钟 P：罐内绝对压力，MPa γ：蒸汽的比容，m3/kg 3.冷却阶段
需要计算的是冷却的时间，尽可能快的降温，减少培养基营养成分的损失。
T = W*C1/G* C2 ×(A/1-A) ×ln（t1s–t2s/ t1f–t2s） 式中——W、C1：分别表示培养基的重量和比热，Kg、KJ/Kg*℃
G、C2：分别表示冷却水的流量和比热，Kg/hr、KJ/Kg*℃
t1s：培养基开始冷却的温度，即灭菌温度，℃
t1f：培养基需要冷却到的温度，即接种的温度，℃
t2S：冷却水进口的温度，℃
A = exp
[KF/GC2]
×（t1–t2s/ t1–t2）
式中——G、C2： 分别表示冷却水的流量和比热，Kg/hr、KJ/Kg*℃
F、K：意义同前
t2S：冷却水进口的温度，℃
t1：被冷却介质的任何一个温度，℃
t2：与被冷却介质温度t1相对应的冷却水的出口温度，℃
思考题：
1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？ 2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？ 3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行有缺点比较？
4.双酶法淀粉的水解通常使用哪2种酶？其作用特点分别是什么？
5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？
灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。 6.生物反应器灭菌的操作要点有什么，绘图说明操作过程。 7．以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。 8．掌握以下几个概念：
理论灭菌时间、对数残留定律、实消、空消、连消、波美度
第四章 发酵机制与代谢控制
微生物的代谢产物很多，主要有乙醇、丙酮、乳酸、氨基酸、酶制剂、抗生素等，在这些产物中，乙醇、丙酮、乳酸等，微生物可以在特定的外部环境下生成，这类发酵我们称之为：自然发酵。
而有些产物诸如：氨基酸、酶制剂等，正常的微生物是不能
在培养基中大量的合成与积累，是需要通过：化学的、物理的、生物的等方法人为的改变其原来的代谢途径，使之能够分泌并积累特定的产物，这类发酵称之为：
代谢控制发酵 ？
对于前者，人们可以在简单了解其代谢合成机制的条件下，通过对环境的控制，来提高其产量和产率，而实现大规模的工业生产。（产量和产率？产量是指：一批次的产量；产率是指底物与产物的转化率，产量高不一定产率高；相反，产率高不一定产量高，两者对于大规模的工业化生产都很重要）
对于后者，人们不但需要严格的控制环境，通常还需要对其代谢机制有系统地了解，才能够提高其产量和产率。
本章的主要内容就是研究微生物的各种代谢调节机制，有助于提高对微生物发酵的本质的认识。
§4-1 糖的代谢与调节
本节主要介绍糖代谢的几条代谢途径，和其调节机制，并简单介绍糖代谢的直接产物：甘油、乙醇等厌氧发酵。 一、糖代谢的途径 糖代谢的主要途径有： 1.糖的酵解途径——EMP途径
其产物是：丙酮酸
丙酮酸还原：乳酸发酵
脱羧，生成乙醛，乙醛还原 在有氧的条件下， 在厌氧的条件下： 生成乙醇
2.TCA循环
丙酮酸在有氧的条件下，在丙酮酸氧化脱羧酶系（脱氢酶）的作用下，氧化脱羧生成乙酰辅酶A，CH3-CO-SCoA，进入TCA循环，彻底氧化成CO2和H2O。
反应式如下： TCA一圈，即每分子乙酰
辅酶A氧化，有：
C6H12O6 = 6CO2 + 6H2O +38ATP+ 3 NAD(P)H 3ATP*3=9ATP
1 FADH 2.5 ATP
1 GTP
总计：12.5ATP*3= 37.5+2ATP(EMP)?
3.HMP途径（磷酸戊糖途径）
将葡萄糖彻底氧化成CO2和H2O，并有35分子的ATP生成， 特点：（1）中间代谢产物中有，C7 、C5 、C4 有利于微生物的
合成代谢。（2）只有NADP参入氧化脱氢反应，可以产生大量的NADPH（3）是一条高产能的氧化途径。 反应式：C6H12O6 = 6CO2 + 6H2O +38ATP 4.ED 途径
常见的是细菌的ED途径，发酵生产乙醇。 应式：C6H12O6 = 2丙酮酸 +2TP + NADPH + NADH 上述这些代谢途径在许多微生物体内可以同时存在，只有极少数的细菌是以HMP为唯一的有氧氧化途径（醋酸细菌、工业醋酸细菌等）。当EMP 、HMP、 TCA、ED中的任意两条途径同时存在于同一种微生物体内时，其比例因不同的菌株、同一菌株也因不同的生长和环境条件不同而异。
例如：在谷氨酸发酵中，菌体生长期：EMP / EMP =38%
GA 合成期，EMP / EMP =26% 二、糖代谢的调节机制 1.糖代谢的能荷调节
能荷 = [ATP] +1/2[ADP] / [ATP] +[ADP] +[AMP] 显然，能荷在0——1之间。
G 磷酸化酶
酸果糖激酶 糖原 葡萄糖 产生ATP，关键酶 柠檬酸合成酶 异柠檬酸脱氢酶
能荷降低，则激活上述关键酶的活性，
同时抑制糖原合成酶的酶活性，加速糖分解，产生APTP，使能荷增加；
能荷增加，则抑制上述关键酶的活性，使糖的降解速度下降，ATP的生成速度降低，同时激活糖原合成酶的酶活性，糖原合成速度的增加，一方面减少了ATP的生成，又消耗了ATP（糖原合成需消耗能量），糖代谢流 发生了转变。
因此，能荷对糖代谢的调节是方向性的。 2.生物素的调节
生物素对糖代谢的调节与能荷的调节是不同的，后者是对糖
代谢流的调节，而前者（生物素）的主要作用是对糖降解速率
的调节，通常生物素能够促进糖的EPM途径，对TCA循环也有促进作用，对糖的HMP 途径也有促进作用，但是，对上述三条途径的促进作用的大小却不同，对EMP 途径的促进作用较大……。生
物素在微生物发酵领域的作用后述。 3.磷酸盐的调节作用 三、酵母菌的酒精发酵
以淀粉质为原料的酵母菌的酒精发酵曾经是我国轻工业行业的支柱产业，现在由于化学合成法酒精的规模化，使得酵母酒精发酵行业越来越萎缩，但由于白酒生产在我国仍然有着较大的市场，这其中就有一部分是由酒精勾兑生产出的，所以，今天比较详细地介绍一下酒精生产工业。
四、酵母菌的甘油发酵
1.行业简介
甘油是重要的工业原料，推动甘油行业快速发展的却是战争，炸药的生产。目前，甘油的用途主要有：
在化工领域：环氧氯丙烷，改性醇酸树脂、酚醛树脂等 医药工业：添加剂，润滑剂等
食品工业：甜味剂、保湿剂，对风味也有独特的影响
在造纸、皮革、玻璃、化妆品等行业：约1700多种产品需要。 它 生产方法：
1.天然油脂为原料：天然油脂 肥皂，废水回收甘油 原烟台第二化工厂生产军用甘油，其副产品…… 2.以丙烯为原料合成 壳牌的氯化法，过乙酸法 3.发酵法甘油生产
添加亚硫酸盐的甘油发酵法是德国第一次世界大战中研究生产的，随后各国分别采用了许多先进的生产设备，但是甘油发酵
的基本原理是相同的都是采用厌氧发酵法。
厌氧发酵法甘油的生产，由于发酵过程中添加了亚硫酸盐，酵母的生长和代谢处于碱性的条件下，细胞死亡率较高，因此有人提出了甘油发酵的新方法——好氧发酵法，即是在甘油发酵过程中通风，以减少酵母细胞的死亡率；另一方面，在适当的氧的存在下，酵母细胞可以进行有限的有氧代谢，为其自身的生长提供必需的ATP（甘油发酵不产ATP？），目前各国都在以甘油的好氧发酵为基础，以提高甘油产率、提高酵母的耐渗透压力、提高甘油的总提出率为目标 的科技攻关研究。我国“八五”期间，把甘油发酵列为重点科技攻关项目，由无锡轻工业学院和四川省食品发酵工业设计研究院接受了该研究项目。1991年轻工业部组织的鉴定认为：
1.产菌种，耐渗较高，糖含量25%，甘油浓 度达到，120g/L
2.载体蒸馏技术，由无锡轻工业“甘油研究中心” 在甘油：糖=1：1的
条 件下，甘油的提出率可达到80%。为何有这个1：1？）
目前，以淀粉为原料的甘油生产已经有工业化装置，全国共20多家生
产企业采用发酵法生产甘油。1995年，在无锡轻工业学院成立了 “中国发酵工业协会”下属的，“甘油发酵专业委员会”，以推动我国发酵甘油的工业化进程。
我国发酵甘油在技术上与国外主要存在以下差距： （1）残糖高，……（2）规模化较少，……
我国甘油市场的构成与西方发达国家相比也有较大的差异，如下所示：
中国：涂料，49%；医药食品，10%
美国：涂料，10%；医药食品，54%以上
这种甘油消费市场的差异，导致了目前我国发酵甘油市场的疲软，影响
了发酵法甘油生产和技术的快速发展。我国甘油消费的增加速度也非常缓慢，年均消耗量在7——8万吨，与我国的整体经济增长不成比例；与欧洲、美国的使用量也不成比例，欧洲：19万吨；美国：16万吨。
2.甘油合成机制
酵母细胞内葡萄糖的降解如下： 葡萄糖（磷酸化，葡萄糖激酶）
（磷酸果糖激酶） ATP ATP
1,6—二磷酸果糖
（醛缩酶） 3-磷酸甘油醛 磷酸希醇式丙酮酸 丙 酮 酸
NAD(P)H
磷酸二羟丙酮
NADH 乙 醛
α-磷酸甘油 NADH
（甘油激酶） 乙 醇
甘 油 （乙醇脱氢酶）
（1）在厌氧的条件下
乙醇脱氢酶的活性很强，菌体的代谢流 流向合成乙醇的方向，而磷酸二羟丙酮又可以迅速的在磷酸丙糖异构化酶的作用下转变成3—磷酸甘油醛，因此，在厌氧的条件下，酵母大量的将葡萄糖转变成乙醇，而产物中只有很少的甘油，在酵母菌的其他厌氧发酵产品中（白酒、葡萄酒、黄酒等），甘油的含量也很少。
那么，如何利用上述代谢途径厌氧发酵生产甘油呢？
显然需要切断乙醇的合成途径，方法如下：
a. 向发酵液中添加适量的亚硫酸氢钠(NaHSO3)，则有下列反应 乙醛 + NaHSO3 == 乙醛亚硫酸氢钠加成物？
则，NADH没有受体，使得菌体的代谢流 转向合成甘油的方向进行，从而生产大量的甘油。
b. 在碱性的条件下，则有下列反应（双分子歧化反应） 乙醛 + 乙醛 == 乙醇 + 乙酸
则，NADH没有受体，使得菌体的代谢流 转向合成甘油的方向
进行，从而生产大量的甘油。
厌氧甘油发酵的能量和转化率的问题： 每分子葡萄糖生成双分子的丙糖（两分子C3）的同时，需要2分子的ATP作为酵解的能量（酵解的一、二步反应），其中一分子的C3（3-磷酸甘油醛）经过一系列的生化反应生成一分子的丙酮酸，并伴有底物水平磷酸化生成2ATP；如果，另一分子的C3（磷酸二羟丙酮）被还原生成α—磷酸甘油，进而生成甘油，则整个甘油发酵没有能量产生，那么，菌体不能够保持活力，而趋于死亡。即便是这样，要保持甘油的生成，必须有一分子C3（3-磷酸甘油醛）流向乙醛的生成方向，才能够有2分子的底物水平磷酸化ATP的生成，葡萄糖的降解才能够达到能量平衡。从这个意义上讲，以葡萄糖为原料的甘油的厌氧发酵，产率不可能突破50%的转化率，这也正是著名的？ 厌氧甘油发酵的缺点：
以上分析足可以看出甘油厌氧发酵的缺点： a.菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生；
b.转化率较低，按照上述能量平衡计算，糖与甘油的转化率不可能超过50%，加上酵母增殖需要消耗一部分糖，发酵液中残留一
部分糖，实际转化率远低于50%。这一转化率，导致了厌氧发酵生产甘油的成本较高。因此，人们正在研究开发新的甘油发酵生产技术——好氧发酵法。 （2）好氧发酵
在适当（或者说有限的好氧）好氧的条件下，酵母细胞进行有限的好氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸可以通过TCA循环来增加其产能水平，一方面减少3—磷酸甘油醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例；另一方面，增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率，有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。但是，这种有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行TCA循环的同时，也增加了TCA循环过程中的许多中间性产物的产生，这对于甘油的提取带来了不利的影响。目前，甘油的总提取率大约在87%左右，要降低发酵甘油的生产成本，提高甘油的提取率具有很大的潜力。提高甘油的提取率，改善发酵液的组成，降低发酵液中残糖浓度，减少发酵液中副产物的含量，是非常重要的。
§4-2柠檬酸发酵机制与代谢调控
一、 行业简介：柠檬酸又称为：枸橼酸，是目前由微生物发酵生产应用最
为广泛、产量最高的有机酸。其主要用途：食品、饮料、医药、化妆品、洗涤剂、建材等领域。
最早的柠檬酸是从柠檬中提取的，故命名为柠檬酸。后来采用发酵法生产。世界上最早的发酵法柠檬酸生产是1923年的比利时，采用浅盘法 发酵生产？
1952年，美国的Miles 公司以淀粉质为原料，经水解后，深层发酵获得成功。我国1953年刚开始也是采用浅盘法发酵生产柠檬酸，60年代后期，开始采用液体深层发酵法生产柠檬酸。
目前，我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也是处于世界领先水平，并远远领先于其他国家，其优势在于：
1.我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺，降低了生产成本。
2.尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64小时，生产周期比国外的单边发酵周期还要短。
3.柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平。平均产酸速率是国外的2 倍。
二、柠檬酸的生物合成途径 葡萄糖
丙酮酸 + 丙酮酸 乙酰辅酶A(CH3CO-CoA) CO2固定反应
草酰乙酸 +
（柠檬酸合成酶）
柠檬酸 顺乌头酸酶
异柠檬酸
异柠檬酸脱氢酶
α—KGA
琥珀酸
按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶 的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。
菌体有了上述特点，只是具备了合成并积累一定量的柠檬酸的条件，要想大量的合成柠檬酸，或者说，追求柠檬酸的高产率，还需要解决柠檬酸合成过程中的代谢调节与控制的问题。 三、柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制
柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？ 分述之：
1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节
从葡萄糖 柠檬酸的合成过程中，PFK 是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，……
研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+ 浓度是如何升高的呢？
进一步的研究表明，柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+ 缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由
+
于Mn的缺乏，使得微生物体内NH4浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。
Mn+ 缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？
当培养基中Mn+ 缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4的消耗下降，NH4浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：
氨基酸 合成 蛋白质 分解 氨基酸
氨基化合成氨基酸
2.顺乌头酸酶活性的控制
该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。由于该酶的活性受到Fe2+ 的影响，控制培养基中的Fe2+ 的浓度，可以使该酶失活。因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢为反应器的材料，目的就是控制培养基中的Fe2+ 的浓度。但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+ 的浓度有要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。 3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响
那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：……，是+
+
++
不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？ 提问：根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？ 菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代
谢途径需要畅通，在这个过程中，有一步反应：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。而实际上，确实柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。为了解释这种现象，有人提出了一种假设：该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。后来的大量的实验证明，在某些微生物体内确实存在一条这样的侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。
理论可以指导实践，反过来，通过实践可以推动理论研究，丰富理论研究成果。 科学研究过程中的许多基本规律是相同的，
今天，我们在大学的学习，更多的是学习一种方法或者说一种思维。通过这个例子，我们可以学习到许多专业以外的知识……首先为了解释一种客观想象，提出一种假设，然后通过实验来证明这种假设…… 四、柠檬酸发酵的产率
一个工业化的过程，产率问题是必须研究的问题。按照上述柠檬酸发酵过程中的代谢控制要求，菌体可以将葡萄糖转化成柠檬酸，但是，如果葡萄糖经过EMP途经生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)，则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CoA，也就是需要1.5分子的葡萄糖；试想，如果其中一分子的丙酮酸通过CO2固定反应生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要1分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。
1.无CO2固定反应的产率
192 /( 180*1.5) == 71.1% 2.通过 CO2固定反应提供C4二羧酸 192 / 180 == 106.6%
C6H12O6 C6H8O7 (C没有增加) 可见，CO2固定反应堆与柠檬酸发酵的重要性。 在柠檬酸产生菌内，存在下列CO2固定反应：
（1）磷酸烯醇式丙酮酸 + CO2 == 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
（2）丙酮酸 + CO2 === 草酰乙酸（C4二羧酸） 酶：丙酮酸羧化酶
以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。
总之：
在柠檬酸发酵过程中，存在三个控制要点：
C6H12O6 控制Mn+ NH4+浓度，解除柠檬
酸读对PFK的抑制
（1）点：EMP畅通无阻 控制溶氧，防止侧系呼吸链失活
丙酮酸 + 丙酮酸 （2）点：通过CO2固定反应生成C4二羧酸，
强化这一反应的方法：
乙酰辅酶A + C4二羧酸
柠檬酸 （3）点：柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低，
控制培养基中的Fe 的浓度
2+
五、柠檬酸产生菌的育种
柠檬酸发酵和其他代谢控制发酵一样，都是在环境水平上的代谢控制发酵，亦即，选育有代谢技能的突变株，在有控制的培养基上，在有选择的条件下，才能大量合成产物。因此菌种的选育是非常重要的，根据菌种选育的方法不同可以分为：分子生物学水平上的、传统的。
分子生物学水平：选定特定的基因（需要大量的基础工作）
加在？某一载体上（宿主细胞，Host）
在特定的条件下的基因表达 今天介绍的是传统的方法： 1.透明圈大的菌株
平板：10%甘薯 + 2 %的琼脂 + 0.5% CaCO3
诱变后，涂布，透明圈大的则好，为何？淀粉的水解能力。 2.现色圈大小
平板：麦汁培养基 + pH值指示剂
诱变后，33℃培养3天，透明圈大的则好。 3.不分解柠檬酸的菌株
不利用柠檬酸为碳源进行生长的菌株，说明其TCA循环中柠檬酸后述的酶的活性较低，或者丧失，这有利于柠檬酸的积累。
方法：以柠檬酸为唯一的碳源的培养基上，选择生长不好的突变株。
4.选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株
在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。（为何？中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）
§4-3 GA的生物合成机制与代谢调节
GA发酵作为重点：（1）是代谢控制发酵的重点
（2）是目前代谢控制发酵中，在理论与实践
上最成熟的……
一、GA 的生物合成途径
主要有：Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循环 乙醛酸循环途径，DCA循环 CO2固定反应 α-KGA的还原氨基化
这6条途径之间是相互联系和相互制约的，如图所示： C6H12O6
HMP
3-磷酸甘油醛
乳酸 丙 酮 酸 乙酰辅酶A CO2 草酰乙酸 柠 檬 酸
苹果酸
异柠檬酸
延胡索酸
琥珀酸 NADPH
α—KGA
NADPH
NH4+ 谷氨酸
二、GA生物合成的内在因素
从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件：
1.α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失
这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可以看出，
α—KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。 2.GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失
（1）如上图所示，NADPH是α—KGA还原氨基化生成GA必须
物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。
（2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH
有一定的积累，NADPH对于抑制α—KGA的脱羧氧化有一定的意义。
3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。
该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。关于该酶的酶活性的调节后述。
4.菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性
α—KGA + NH4+NADPH == GA + NADP
L—谷氨酸脱氢酶，实质上GA产生菌体内该酶的酶活性都很强 该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联，反应机制如下：
α—KGA NADPH α—KGA GA NADP 异柠檬酸 三、GA 生物合成的最理想途径
上述涉及到的GA生物合成途径很多，那GA 生物合成由哪几条途径合成是最为理想的呢？ 通过比较来说明这一问题：
1. 在前述GA 合成所必需的条件的基础上（……，封闭乙醛酸循环）体系不存在CO2固定反应，则有：
3/2Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸 + 丙酮酸 CO2
乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A + 乙酰辅酶A
柠檬酸（DCA循环封闭）
谷氨酸 则有：
3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + 4 CO2
产率：147 /（180*3/2） == 54.4%
+
2.在前述GA 合成所必需的条件的基础上（……，封闭乙醛酸循环）存在CO2固定反应，则有：
Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸
CO2 CO2 草酰乙酸
（草酰乙酸 羧化酶）
乙酰辅酶A + C4二羧酸
苹果酸
（苹果酸激酶）
柠檬酸（DCA循环封闭）
谷氨酸
C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + CO2
产率：147 / 180 == 81.7%
可见，在GA的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。
在许多微生物发酵的过程中，通常需要检测反应器尾气的组成，特别是尾气中CO2的含量，其主要目的就在于分析产物合成期间菌体的代谢途径，有利于指导生产。
在GA产生菌菌体内CO2固定反应有以下两条途径： （1）磷酸丙酮酸羧化酶的作用下
磷酸丙酮酸 + CO2 + GTP == 草酰乙酸 + GDP
(2) 苹果酸合成酶的作用下
丙酮酸 + CO2 +NADH === 苹果酸 + NAD 需要Mn+做催化剂，所以，在GA发酵过程中需要向培养基中补充Mn+
实际上，发酵过程中不可能控制柠檬酸合成所需的C4二羧酸完全来自于CO2固定反应，体系也不可能完全不存在CO2固定反应，因此，GA 发酵的糖酸转化率应在：54.4%——81.7%。目前，国内的GA生产企业的糖酸转化率通常都在50%以内：
（1）企业计算的糖酸转化率是把GA 发酵前期菌体增殖时期消耗的葡萄糖计算在内，而我们所计算的不包括这一部分葡萄糖，通常这一部分糖占总量的20%左右，当然与企业的技术水平有关。
（2）TCA 循环也不可能完全封闭；α—KGA也不可能完全转化为GA；生成的GA也不可能完全分泌的细胞外；发酵液中还存在一定的残唐，通常在0.5%——0.7%之间。
无论如何，提高GA的潜力仍然是很大的，具体表现在： （1）强化CO2固定反应，具体措施：Mn+ ，生物素？ （2）控制溶氧浓度是非常重要的
低的溶氧浓度，则丙酮酸向乳酸方向转化…… 高的溶氧浓度，则NADPH 有被氧化的可能，…… 四、生物素对GA发酵的影响
GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-，在发酵过程中要严格控制其浓度，主要是生物素对发酵的影响是全面的，分述如下：
1.生物素对糖代谢的影响
一方面，VH对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——
乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。
另一方面，可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。前述，封闭乙醛酸循环对于GA发酵的重要性，那么，如何封闭乙醛酸循环呢？
DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：
为醋酸诱导
受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制 （受到Glucose的阻遏？） 这样，当VH缺乏时：
（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作
用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；
（2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀
酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；
两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA循环得到封闭。
2.生物素对氮代谢的影响
由以上分析可知，当VH缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当VH丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA
循环正常进行，DCA循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。 以上分析说明，GA发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。 3. VH对菌体细胞膜通透性的影响
细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，正如前述，当菌体进入产物合成期时，开始有GA的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA对L—谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使现由
Glucose GA的高效率转化，反之，如果……。可见，改善细胞膜通透性的重要性，如何进行呢？
通常谷氨酸发酵采用的菌种都是VH-，而VH又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通过控制VH的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性的调节。
VH对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径如下：
葡萄糖 丙酮酸 + 丙酮酸
乙酰辅酶A 乙酰辅酶Ａ
乙酰辅酶A羧化酶 CO2
CO2 丙二酰辅酶A C4
丙二酰辅酶A CO2
C6
其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是VH，VH在此反应过程中起到传递CO2的作用。当培养基中VH的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。 培养基中生物素限量时，胞内AA 92% 胞外
培养基中生物素丰富时，胞内AA 12% 胞外 五GA发酵的外在因素
GA发酵是一个典型的代谢控制发酵，固然有其内在的菌体特性，诸如：？（提问），但是正如任何事物发展的基本规律一样，外在因素仍然有重要的作用，对于GA的发酵也是一样。 1.供氧浓度
过量：NADPH的再氧化能力会加强，使α—KGA的还原氨基化
受到影响，不利于GA 的生成。
供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于
GA的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。
2. NH4+浓度
（1）影响到发酵液的pH值
（2）与产物的形成有关：
过低，不利于α—KGA的还原氨基化 过高，产生固安酰胺（？，缺点？） NH4+的供给方式：
（1）液氨 （2）流加尿素，条件和优缺点？ 副反应： 3.磷酸盐
过量：（1）促进EMP途径，打破EMP与TCA之间的平衡，积累
丙酮酸，产生乳酸等……
（2）产生并积累Val， 途径如下：
Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸
（焦磷酸硫胺素，TPP）
活性乙醛
α—乙酰乳酸 Val Val（1）可以抑制葡萄糖 丙酮酸，使GA的生物合成受到阻止 （2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率
（3）发酵液中的Val存在，严重的影响GA 的结晶、提出。
§4-4 Lys的生物合成机制与代谢调节
一、行业简介
二、赖氨酸的生物合成机制
目前已知的赖氨酸生物合成途径有两条，以细菌类为主的一条、以酵母菌为主的一条合成途径。由于酵母菌体内的赖氨酸的生物合成产率要低于细菌类的，因此，目前的赖氨酸发酵生产都是采用细菌为生产菌种。在微生物发酵过程中，通常细菌和酵母菌两者的各有优缺点，试比较如下： 细菌类发酵与酵母菌发酵的比较：
优点：（1）菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。
（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有
几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。
（3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过
其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。
缺点：（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于
产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。（3）细菌发酵易感染噬菌体。 细菌赖氨酸发酵使用的菌种通常有两种类型，
分述之：
1、大肠杆菌中的Lys的生物合成与代谢调控：
大肠杆菌中的Lys生物合成途径要比黄色短杆菌、谷氨酸棒杆
菌、乳糖发酵短杆菌的代谢调控要复杂，过程如下：
Glucose EMP 丙酮酸
草酰乙酸
Asp
(天冬氨酸激酶AK，同功
酶)
天冬氨酸磷酸（asp-p）
天冬氨酸β-半醛
（同功酶）
二羟吡啶羧酸
Lys
Met Thr
大肠杆菌赖氨酸代谢特点：
关键酶：天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三
个终产物分别是：Lys、Met和Thr，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp激酶的活性才能完全被抑制。
同功酶：催化同一反应，但其活性受不同代谢产物体调节的酶。 2.黄色短杆菌Lys生物合成的调控
珀酰高丝氨酸 O-磷酸高丝氨酸 高丝氨酸（Hos）
Glucose EMP 丙酮酸
草酰乙酸
Asp
(天冬氨酸激酶，AK)
天冬氨酸磷酸（asp-p）
天冬氨酸β-半醛
二羟吡啶羧酸 高 丝 氨 酸
O-磷酸高氨酸
Lys
Met
O-琥珀酰高丝氨酸
Thr
-
根据上述代谢特点，要使菌体合成并积累Lys，可以选育Hos，这样的话，
既可以解除β—天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos，使得代谢过程中不可能产生过量的Met、Thr，尽管产生了大量的Lys，Lys可以抑制关键酶——天冬氨酸激酶1，但是天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met、Thr的限量，
-
并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸β—半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys的生物合成途径的畅通无阻。
黄色短杆菌与大肠杆菌（E.coli）的区别：
（1）天冬氨酸激酶（AK），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys、Thr的协同反馈抑制，？ 协同反馈抑制，就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。 （2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，如图所示（ ），即优先合成Hos，然后再优先合成Met，当Met过量时，阻遏：催化Hos 琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成Thr的方向进行，当Thr过量时，反馈抑制：Asp-β-半醛 Hos所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向Lys的合成上。
根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产Lys，需要选用Hos， 其意义在于：
（1）解除了Hos的优先合成机制，阻断了代谢向Met、Thr的方向进行，节省了原料，可以使Asp-β-半醛这个中间代谢产物全部转入Lys的生物合成上。
（2）在培养基中限量的供给Met 、Thr（或者Hos），对于AK酶活性的调节有着重要意义。因为AK酶是一个协同反馈抑制的变构酶，限制了其中某一个抑制物（Thr），则Lys的浓度再高，也不会影响到AK酶的活性，那么，代谢一直向着赖氨酸合成的方向进行，使得产物的合成畅通无阻。
尽管，从理论上讲，选育Hos- 进行赖氨酸发酵，如果在其培
-
养基中限量供给Thr，则AK酶的活性不会受到Lys的反馈抑制，实际上Lys对AK酶的活性存在一定的抑制作用（课本，第73页，表6—1）。因此，对于黄色短杆菌的Lys发酵，仅仅选育Hos- 是不够的，但是为了高效率的转化Lys，需要解决这一问题： 是该酶（AK）脱敏（就是该酶具有抗反馈抑制或阻遏的能力），如何使其脱敏呢？
可以选育结构类似物抗性突变株？（X r）
(1)S-L-半胱氨酸抗性突变株 AEC (2)γ-甲基赖氨酸抗性突变株 MLr （3）L-赖氨酸氧肟酸盐抗性突变株 LysHxr （4）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr
使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）,其本质上和Hos- 是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：遗传性质稳定，恢复突变的几率少。
r
§4-5 抗生素的生物合成机制与代谢调节
一、次级代谢与初级代谢的关系 1.基本概念
初级代谢：是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如：
糖、氨基酸等以及由这些化合物形成的高分子物质如：多糖、蛋白质、核酸等的代谢，称之为初级代谢。那么，这些化合物统称之为：初级代谢产物。
次级代谢：是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显
关系的代谢，这一类的物质统称之为：次级代谢产物。例如：抗生素、激素、某些酶制剂等。
其特点为：结构比较复杂，其合成的代谢过程比较复杂，大部
分的合成机制到目前为止，尚没有搞清楚。
2.从菌体代谢途径上看两者之间的关系
许多抗生素等次代谢产物的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以次级代谢产物是以初级代谢产物为母体衍生出来的，次级代谢途径并不是独立的，而是与初级代谢途径有密切关系的，如下图所示。
从下图可以看出，许多物质处于代谢的分叉点上，例如：CH3CO-SCoA，是葡萄糖糖经HMP、 EMP生成的中间物质，经羧化后可形成丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A可用于脂肪酸的合成上，进而又可经多次重复缩合、环化等形成四环类或其他抗菌素等次级代谢产物，而CH3COSCoA又可以进入TCA循环。这类物质称之为：分叉中间体。如：丙酮酸、乙酰辅酶A、草酰乙酸等
这些个分叉中间体把微生物的次级代谢和初级代谢紧密地联系起来
Glucose
C3 丝氨酸 甘氨酸 莽草酸 丙酮酸 Val 次级代谢产物
芳香族氨基酸
芳香类次级代谢产物
丙二酰辅酶A 乙酰辅酶A
脂肪酸
次级代谢产物
TCA循环
草酰乙酸、α-KGA 谷氨酸
Met 天冬氨酸 次级代谢产物
次级代谢产物
3.从代谢调控上看两者之间的关系
两者都分别受到微生物的代谢调节控制，但在代谢调节上，两者又是相互影响的。研究表明：当抗生素合成的初级代谢途径受到控制时，即，Val对α—乙酰乳酸脱氢酶产生反馈抑制时，青霉素的生物合成必然受阻。从这种意义上讲，研究次级代谢的调节与控制要比初级代谢复杂得多，因为初级代谢的控制直接影响到了次级代谢。
二、抗生素的生物合成途径：
抗生素的生物合成途径是比较复杂的，目前有许多抗生素的生物合成途径尚不清楚，还有许多是属于推测性的。这一部分的内容不作介绍，有兴趣的同学可查阅相关书。 以青霉素的合称为例： 青霉素的合成如下：
Glucose 丙酮酸 + 丙酮酸
（焦磷酸硫胺素，TPP）
活性乙醛 α—乙酰乳酸脱氢酶
α—乙酰乳酸 Val
青霉素
实验表明： 选育α—乙酰乳酸脱氢酶对Val不敏感的菌株，则
可以提高青霉素的产率。
三、抗生素的代谢调节机制
微生物体内有着微妙而科学代谢调节系统，在微生物体内存在多种生化反应，也就有多种的酶参入，这些酶的活性很大一部分是受到其代谢产物的调节与控制的，但是调节与控制的方式是不同的。总体上讲，存在两大类酶活性调节方式：抑制与阻遏 抑制：酶活性的抑制，对于多酶体系，则有：协同、增效、同
工酶等
阻遏：酶合成的阻遏
前者是对酶活性的抑制，是被动的调节；后者是对酶的生物合成的阻遏，是主动的而有效的。
在抗生素的生物合成过程中，由于存在极为复杂的生物化学
过程，也就存在极为复杂的调节与控制机制，这里只从大的方面谈一下：
1.菌体由生长型到产物积累性的转变
初级代谢在大多数的情况下，产物的合成与菌体的生长是同步进行的（GA酸等除外），而次级代谢产物的合成只有在菌体完成增殖并停止生长以后，才有产物的生成。对于分批（batch）发酵过程，细胞在生长期，没有产物的形成，这一时期，参入次级代谢的酶系处于抑制状态，一旦细胞生长结束，则这些酶的活性被激活或者其合成机制被激活（阻遏被解除），这时次级代谢产物开始合成。可见，菌体实现从生长型到产物积累型的转变，是次级代谢发酵成功的关键，那么，菌体是如何完成这种转变的呢？
目前，由于基础理论的研究不够，引起上述转变的机制尚没有搞清楚（GA发酵研究得很清楚，它是初级代谢产物，生成的途径、机制有关的酶系也很清楚，但是大多数次级代谢产物的合成途径尚没有搞清楚，涉及到的酶系非常复杂……）因此，在次级代谢发酵工艺中，来完成这种转变的方法也没有固定模式，不同的发酵，采用不同的方法：
（1）在大多数的抗菌素发酵过程中，控制培养基中的特定的营养成分，当微生物达到生长平衡后，由于培养基中的特定的营养成分的减少，微生物停止生长，微生物群体则实现了从对数生长型到产物积累型的转变，这时，从微观的角度看，微生物的代谢流 发生了转变；从宏观的角度看，微生物对于环境的要求也发生了转变（比如：溶氧水平的升高，pH值的改变等），其本身的形态也会发会发生变化，例如：庆大霉素的发
酵（放线菌）在菌体的增殖期，菌丝体细长，而进入庆大霉素的合成期，菌丝体变得粗短，……
（2）在酶制剂的发酵生产中，引起上述变化的因素仍然是
不确定的，大多是情况下，是由于限制性营养成分浓度降低所致。
本人对地衣芽孢杆菌的耐高温α—淀粉酶发酵的研究研究发现，某些外界条件也可以引起微生物的代谢流的转变，例如：在菌体的增殖期突然停电2小时，停电即意味着发酵液的溶氧浓度DO=0，其结果是，来电后恢复到原来生物反应器的运行状态，但是菌体不能够继续增殖，而是转变成了产物积累型开始合成耐高温α—淀粉酶。这种转变，在微观上仍然是代谢流 的转变，而在宏观上，仍然能够表现出菌体形态的变化，由原来生长期的粗短型，转变成细长。这与同样是细菌发酵的GA酸发酵不同，后者当菌体从生长型转变成产物积累型后，其形态则是由细长转变成粗短型。 2.磷酸盐调节
磷酸盐对抗生素发酵的影响具有双重性，主要表现在： （1）高浓度的磷酸盐对抗生素的生物合成具有抑制和阻遏作用，例如：链霉素、金霉素、四环素等，现已发现有32种抗生素受到磷酸盐的抑制和阻遏。
(2)磷酸盐浓度低时，菌体生长速度缓慢，生长量（菌体浓度）也不够，不利于抗生素的生物合成。
高浓度的磷酸盐对于抗生素合成的影响机制有以下两种情况：
（1）抑制或阻遏抗生素合成途经中的某些关键酶。
已有许多研究证明：当磷酸盐的浓度≧10mmol/L时，菌体内与抗生素合成有关的酶的活性将受到抑制。 （2）高浓度的磷酸盐可以改变菌体的代谢途径。
分析磷酸盐对EMP途径、对TCA循环的影响（促进作用），带来的……；
高浓度的磷酸盐改变MEP：HMP，不利于HMP的进行，当然也不利于以HMP途经中的中间产为前提的次级代谢产物的生物合成。例如：过量的磷酸盐会减少四环素的生物合成，是由于HMP途经中的戊糖浓度降低造成的。 3. NH4+浓度
在抗生物的发酵过程中，培养基中如果存在容易被利用的无机氨态氮，例如：（NH4）2SO4、NH4CL等，或其他可以被迅速利用的氮源，则对抗生素的合成有强烈的抑制作用。
NH4+对于抗生素合成的抑制作用机制目前尚没有搞清楚，有人认为，NH4可以强烈的刺激菌体的生长，进而影响了菌体从生长型到产物积累性的转变，影响了抗生素的生物合成。发酵中期当微生物群体进入产物合成期时，如果向发酵液中流加氮源，则可以造成 发酵逆转 ，使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成，这种现象在次级代谢产物发酵过程中是非常普遍的。
+
发酵逆转 耐高温α—淀粉酶发酵中，流加：G、GA，停电等
§4-6 代谢产物的过量生产
所谓代谢产物的过量生产就是指微生物在一定的条件下或者说在一定的外界条件下，积累并分泌过量的代谢产物。例如：酵母菌在厌氧的条件下积累并分泌大量的乙醇，GA产生军在一定的条件下积累并分泌大量的谷氨酸……
众所周知，微生物细胞内有着非常完善的代谢调节控制机制，使细胞内复杂的生物化学反应可以高度有序的进行，在其生长过长中，能量的利用、各种物质的消耗与合成都是非常合理而经济的，需要多少合成多少，不需要的则不合成，因此，微生物的过量生产就意味着改变了它本身的这种调节机制，这正是现代发酵工业要研究的重要内容之一。
本节分为两个部分分别谈一下如何提高代谢产物的方法，本章前述的几个物质的发酵生产，各有不同的方法，本节实质上就是对前述内容的系统总结。
一、提高初级代谢产物产量的方法
初级代谢产物不同于次级代谢产物，微生物对于初级代谢的调节控制要比次级代谢控制要强烈的多，因此度对于提高初级代谢产物产量的方法不同于…… 1.使用诱导物
对于许多酶类的发酵，特别是淀粉、蛋白质的水解酶，其大部分是诱导酶，对于这一类的酶类的发酵，向培养基中添加诱导物，可以促进酶的合成与分泌，有利于提高产量。
但是，诱导物往往是比较昂贵的，经济上并合算。例如：耐高温α—淀粉酶诱导物是乳糖，如果使用乳糖作为诱导物的话，生产成本很高，经济上是不可行的，乳糖作为诱导物通常在……。在实际生产中要选择一种廉价的、高效的诱导物是很困难的，通常选用诱导物的结构类似物是最理想的，因为结构类似物不能够被诱导产生的酶水解，可以在培养基中一直保持一个较高的、稳定的浓度，能够持续发挥诱导作用，从而得到较高的酶活。但结构类似物的选育？到目前为止，在生产上尚没有使用诱导物成功的例子。那么，对于这一类型的发酵，如何提高……？
2.选育组成型突变株
诱导机制：目前最清楚的是大肠杆菌的乳糖操纵子
无诱导物：
S R P O
产生有活性的阻遏蛋白，结合到操纵基因上，使NDA中的结构基因不能翻译（蛋白质），酶不能够合成。 R---调节基因，regulatiopn gene P---启动子，Promotor
O---操纵基因，operation gene S---结构基因，structure gene
有诱导物：
R
产生有活性的阻遏蛋白，
阻遏蛋白 + 诱导物
阻遏蛋白无活性，不能结合到操纵基因上， NDA中的结构基因正常翻译（蛋白质），酶正常进行。
如果，通过化学的、物理的或者生物的方法，使上述操纵子中的调节基因发生突变，使之不能够合成这种阻遏蛋白，或者合成的阻遏蛋白无活性，或者突变发生在操纵基因上，那么，
P O S 酶的这种诱导作用就解除了，酶的合成畅通无阻，这种突变株称之为，组成型突变株。
组成型突变株是微生物发酵领域，生产具有诱导机制的代谢产物行之有效的方法。
组成型突变株的选育方法？（可以作为作业） 3.解除分解代谢阻遏
分解代谢阻遏：当培养基中同时存在多种可供利用的底物时，分解利用某些底物的酶往往被最容易利用的底物所阻遏。 分解代谢阻遏，又称之为，葡萄糖效应。微生物细胞的这种机制保证了细胞只有在利用某些底物时才合成与之有关的酶类，而且保证了多种底物同时存在时，优先利用最好的底物，就像嘴馋的人一样，这对于细胞来讲无疑是极有意义也是极为合理的。 例如：
把E.coli培养在Gluose + 乳糖的Medium 中，其大肠杆菌的生长明显存在两个对数生长期。原因是E.coli在利用Glucose时，分解利用乳糖的酶——β—半乳糖苷酶的合成受阻，只有当Glucose被利用完以后，上述这种对β半乳糖苷酶合成的阻遏作用随之消失，于是出现了菌体利用乳糖进行生长的第二个对数生长期。
给生产带来的危害：
在正常的发酵过程中，微生物群体从完成了生长型到产物积累型的转变后，大量的产物开始生成，底物源源不断地转化成产物，但是当培养基中存在易引起分解代谢阻遏的物质时，菌体可能出现二次生长，微生物群体又回到了生长状态，即发生了前述的发酵逆转 ，这显然是不利于提高产量的。
生产中克服分解代谢阻遏的措施：
1抗性突变株的选育： ○
从遗传学看，如果调解基因发生突变，使阻遏蛋白失活；操作基因发生突变，不能与阻遏蛋白结合，那么这种分解代谢阻遏就不存在，有利于代谢产物的过量生产。
2生产中避免使用有阻遏作用的C源、N源 ○
目前已知的不易引起分解代谢阻遏的C源：乳糖、有机酸； 目前已知的不易引起分解代谢阻遏的N源：黄豆粉，
黄豆粉之所以不易引起分解代谢阻遏，是因为黄豆粉是一个颗粒状的原料，其中的蛋白质存在于颗粒中，起到缓释的作用。
3流加C源、N源 ○
缓慢的流加C源、N源，使发酵培养基中的C源、N源一直保持在一个均匀的、较低的水平，则有利于消除分解代谢阻遏的出现，可以明显的提高产量。 3.解除反馈抑制：
末端产物对于微生物代谢链中的几个关键酶通常都存在着反馈抑制作用。解除这种反馈抑制的方法有：
1抗性突变株，又称为结构类似物突变株。 ○
例如： G GA Arg
根据上述谷氨酸棒杆菌中的精氨酸Arg的代谢途径，如果要积累Arg，使Arg过量生产，必须解除Arg对GA N---乙酰谷氨酸这一酶促反应的反馈抑制作用。 最有效的方法是选育抗性突变株，Argr
2对于分枝代谢，可以选育营养缺陷型突变株。 ○
前述的Lys的发酵就是这样一个典型例子。
4.防止突变株的回复突变：
经诱变而产生的各种各样的突变株，在生产过程中易于发生回复突变，也就是说其存在一种遗传学上的不稳定性。解决这种恢复突变的方法：
1选择具有双重标记的突变株。 ○
例如，在Lys的发酵中选育具有 Hos- 和Met- 的双重标记菌株，可以提高其稳定性。
2对于抗性突变株。 ○
可以在培养基中加入适量的结构类似物，以防止已经发生回复突变株的抗性突变株 的增殖。 5.细胞膜透通行的调节：
在GA代谢部分讨论过细胞膜透通性对于微生物发酵工业的意义。细胞膜对于物质的进入（透通与排泄）是有高度的选择性的。其输送系统的这种高度的选择性，这主要取决于其 透性酶 的活性与结构。
改变细胞膜透通性的方法主要有：
1改变膜的组成与结构，使之成为不完整的细胞膜。 ○
2破坏细胞壁的合成，使之不能合成完整的细胞壁，由此，细胞○
膜由于缺乏细胞壁的机械保护作用可以改变其渗透性。
3透通性酶活性的调节与控制： ○
上述表明，细胞膜对于要输送的物质具有高度的选择性，这种高度选择性与透通性酶的活性、结构有着直接的关系，而透性酶与其他酶相同，也有着自己的调节与控制机制。研究这种机制，有利于提高微生物的代谢产物的过量生产。
以上是从微生物的代谢机理方面，或者说从微观的角度，论述
了提高微生物初级代谢产物的具体方法和措施，这些措施可以在同一种微生物的发酵中同时使用，也可以单独使用某一种方法。但是，在微生物的工业发酵过程中，提高微生物初级代谢产物，仅仅考虑上述的微观的方法是远远不能够实现大规模的工业化生产，还需要从工程的角度上：
1强化传质包括：底物和排泄的物质，氧的传递。 ○
+
2控制生物反应的均一性。包括：底物浓度，H浓度、氧化还○
原电位、温度等。
③控制泡沫的的生成与消除。
这就是下一章我们要讨论的内容，后述。 二、提高次级代谢产物的方法：
初级代谢产物与次级代谢产物两者是有着明显的区别的，其区别除了前边叙述的，
对于微生物生长的作用不同 产物的结构不同 产物形成的时间不同
除了上述差别此外，对于微生物的过量生产，其培养条件也不相同。初级代谢产物的形成一般只需简单的营养条件，在化学成分确定的培养基中即可生成。例如：Yeast的酒精发酵，柠檬酸发酵、甘油发酵、GA发酵等。而次级代谢产物则需要复杂的营养条件，通常要供给成分复杂的天然物质时才能形成，而且次级代谢产物形成的条件要求特殊，尤其是过量生产，其培养基不同，培养过程中的条件控制也不相同。
通常，次级代谢产物是在菌体生长高峰期后，Medium中的C、N、P、S等基本耗完以后，与这些物质代谢有关的酶系的活力趋于
下降，这时，与次级代谢产物形成有关的酶系逐渐出现，次级产物开始形成。在发酵过程中，研究如何使次级代谢产物进入分化期，即如何诱导or引发次级代谢产物的形成，是目前发酵领域研究的热门课题之一。
这里介绍几种提高次级代谢产物的方法： 1、补加前体（前驱物质）：
在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体，可以有效的提高次级代谢产物的产量。
例如：在青霉素G的发酵法生产中，补加前体物质，苯乙酸or其衍生物，可以明显的增加青霉素的产量。这是因为，在青霉素的发酵生产过程中，苯乙酰—CoA是青霉素G生物合成的限速性因子，受到许多代谢控制，添加苯乙酸or其衍生物后，可以提高苯乙酰CoA的浓度，解除了苯乙酰—CoA对于青霉素G合成的限速，从而提高青霉素的产量。
补加前体的有两个条件：
①前体是产物形成的限速因子，其合成受到众多的控制。 ②必须已知其代谢途径，且补加的前体物质对于M体内其他酶系无抑制作用，否则，影响到了菌体的其他代谢，如：产能代谢等，仍然不能提高次级代谢产物的产量。 2、解除分解代谢阻遏：
抗性突变株 对于初级代谢产物的过量生产，前述方法是： 控制培养基组成 流加技术 对于次级代谢产物的过量生产，使用的方法是：
流加技术 控制培养基的组成
C源：使用缓慢利用的原料，寡糖、多糖、液化淀粉
N源:豆粉、蛋白胨等
提高次级代谢产物的方法，除了上述几种措施外，目前的研究主要集中在培养基的优化上，应该说，这是一种盲目性很大的方法，也可以说是一种很无奈的方法。出现这种情况的原因是由于对于次级代谢产物的理论研究不够深入，这在某种程度上，也给次级代谢产物的生产带来了一定的影响。 本章总结：
1.介绍了几种典型的代谢及其调控机制 厌氧发酵：酒精、甘油 从发酵类型上： 好氧发酵：GA、Lys、柠檬酸等
初级代谢：酒精、甘油、谷氨酸等 从代谢类型上： 次级代谢：抗生素
2.从微生物的代谢机制上，系统地总结了提高微生物代谢产物的方法。
下面一章的内容是在本章的基础上，从宏观或者说从工程的角度，来探讨提高微生物过量生产的方法。
思考题：
1．基本概念：
能荷、糖酵解、TCA循环、HMP途径、甘油发酵、 侧系呼吸链、标准呼吸链、二氧化碳固定化反应、初级代谢、次级代谢、分叉中间体、发酵逆转、反馈抑制、阻遏、优先合成机制、同工
酶、协同反馈抑制、营养缺陷型、抗性突变株、分解代谢阻遏、代谢控制发酵
调节基因，regulatiopn gene P---启动子，Promotor
O---操纵基因，operation gene S---结构基因，structure gene
2.厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。 3.柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？ 4.说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。
5.简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。 6.比较细菌发酵和酵母发酵的优缺点。
7.写出大肠杆菌中Lys代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产Lys 的菌种特性和控制要点。
8.写出黄色短杆菌中Lys代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产Lys的菌种特性和控制要点。
9.简述磷酸盐在抗生素发酵过程中的调节作用。 10.说明微生物细胞内NH+4参与分解与合成代谢的途径。
11.写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO2固定化反应的重要性。 12.谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA，其菌种内在的原因有哪些？
13.谷氨酸产生菌之所以能够在10%以上的葡萄糖培养基上，生产大量的GA,除了上述谷氨酸产生菌的内在本质外，其需要的外在条件有什么？
14.谷氨酸发酵过程中，生物素（VH）作用表现在那几个方面？ 15.生物素（VH）如何封闭乙醛酸循环的？
16.微生物群体当实现从生长型到产物积累性的转变后，从外观上通常会有哪些变化？这些变化的本质是由什么引起的？
17.从能荷的角度解释柠檬酸发酵过程中，“只长菌，不产酸”的原因。
第五章 发酵过程及控制
§5-1 微生物发酵的类型
一、微生物发酵的类型
1.根据微生物对氧的需求不同，可分为：
（1）厌氧发酵：乳酸杆菌的乳酸发酵、酵母的酒精发酵等 （2）好氧发酵：GA、其他AA、大部分的细菌和霉菌发酵 2.根据所用的培养基的状态
（1）固体发酵（solid fermentation）就是微生物生长在固体培养基上
（2）液体发酵:
液体深层发酵（submerged fermentation）
(优点？)
3.按照生物反应器的类型分
(1)敞口式发酵：属于繁殖速度快的好氧发酵，例如酵母工业 (2)半密闭式发酵：酵母菌等的发酵，大多数情况下属于不是
很严格的厌氧发酵。
（3）密闭式发酵：好气性的液体深层培养，要求复杂，但无
浅盘发酵：又称为表面培养
菌程度高。
二、生物反应器的操作方式 1分批式（fed-batch）
是目前微生物培养的最基本的方式，即是以微生物的一个生长周期为一个生产周期，包括设备的灭菌、种子培养、发酵操作。 优点：（1）每一次进行重复的配料、灭菌、等操作，微生物培养
可靠、安全。
（2）微生物发酵过程中，微生物的各个阶段的生理、代谢
特征不同，易于控制。
缺点：（1）效率较低，每次发酵重复进行既是一种时间的浪费，
又是原材料和能量和浪费。
（2）底物利用率低，分次分批发酵都存在一个微生物自身的
增殖过程，增殖本身就是底物消耗的过程，这必然导致转化率的降低，例如，在GA的发酵过程中，微生物增殖所需要的C源占总c源的20%左右。
（3）分批发酵培养基中的底物浓度较高，增加了培养基的渗
透压，不利于微生物的生长。
尽管，分批…… 2.连续操作
基本概念：当微生物菌体达到某一特定状态时，（这一状态可
以是：菌体浓度、比生长速率、产物的比生成速率等），连续向反应器内流加混合底物（C、N、P……），同时反应器排放等量的发酵液。
优点：微生物处于一个稳定的底物浓度和产物浓度的环境中，
从理论上讲，这种方式是最高效率的微生物培养方
式？……节省消耗（底物、能量）
缺点： (1)由于微生物菌种易发生变异，特别是代谢控制发酵
所采用的菌种，大部分是经过诱变的突变菌株，其遗传性质非常不稳定，后期，当菌种发生变异或者说恢复突变的菌体占有优势时，发酵就意味着失败。
(2)长时间的连续培养，防止杂菌、phage的感染也是难以
克服的问题。
§5-2发酵过程中温度的变化及控制
一、发酵过程中的热源
热源：发酵过程中引起发酵液温度变化的原因。 O发酵热 = O生物热 + O搅拌热 + O蒸发热 + O辐谢热
下边分述之
1. O
生物热
微生物在生长过程中，由于培养基中的营养性物
质：糖、蛋白质、脂肪等被氧化，同时产生大量的热量，这些热量一部分用于合成高能物质（ATP\\GTP）等，这些高能物质用于菌体自身的生长、繁殖上；剩余的另一部分，则以热的形式散发出来，其表现在外观上，就是使培养基的温度升高，这一部分热量称之为:生物热
生物热的特点：具有强烈的时间性：不同的生长时期，底物消耗的水平不同则产生的……
与微生物生长过程中的供氧水平有着直接的关系
以酵母菌的生长为例说明：
（1）酵母菌在有氧条件下生长的生物热
在有氧的的条件下Glucose经过MEP途经生成丙酮酸，丙酮酸进TCA循环被氧化成CO2和H2O，并有38分子的ATP生成，总反
应式如下：
C6H12O6 + 38ADP + 38Pi = 38ATP + 6H2O + 6CO2 + O生物热
-10×38×4.18KJ/mol
这一部分的能量用于菌体生长代谢，即△G= -10×38×4.18KJ/mol 根据化学反应的基本原理，对于一个化学反应，可以看成是一个平衡过程，则有下式：
O生物热 = O可逆 = T•△S = △H - △G = -674-(-380) = - 294kcol/mol 式中：△H为反应的焓差，可以计算如下： △H = △HG,C - △HCO2,C - △HH2O,C △HG,C298—葡萄糖的标准燃烧热，-674×4.18KJ/mol △HCO2,C，△HH2O,C 分别表示CO2和H2O的标准燃烧热0. △G 为反应的焓差，即自由能，其值为 -10×38×4.18KJ/mol 则：
O生物热 = -294kcol/mol = - 294×4.18KJ/mol
这就意味着，酵母菌在有氧的条件下，每氧化1mol的葡萄糖则可以产生：
- 294×4.18KJ/mol，用于使发酵液的温度升高。 （2）酵母菌在无氧的条件下
Glucose经过MEP途径生成2分子的丙酮酸，在无氧的条件下完全氧化生成乙醇、CO2。
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi = 2ATP + 2 C2H5OH+ 2CO2 + O生物热
-10×2×4.18KJ/mol 同样，有下列方程：
298
298
298
298
298
O生物热 = O可逆 = T•△S = △H-△G =-674 - 2(-315 ) = - 20kcol/mol 式中：△H为反应的焓差，可以计算如下：
△H = △HG,C - △HCO2,C - △HH2O,C - △H C2H5OH,C △HG,C298—葡萄糖的标准燃烧热，-674×4.18KJ/mol △H C2H5OH,C—乙醇的标准然热，-315×4.18KJ/mol △HCO2,C，△HH2O,C 分别表示CO2和H2O的标准燃烧
热，0
△G 为反应的焓差，即自由能，其值为 -10×2×4.18KJ/mol 则：
O生物热 = -20kcol/mol = - 20×4.18KJ/mol
这就意味着，酵母菌在无氧的条件下，每氧化1mol的葡萄糖则可以产生：
- 20×4.18KJ/mol，用于使发酵液的温度升高。 以上计算表明：有氧代谢和无氧代谢，其生物热差别是很大的。这一计算结果本质上是由于在不同的代谢条件下，形成的代谢产物是不同的，其产能水平也是不同的，因此生物热也不相同。
这种差别提醒我们：
在进行生物反应器的设计时，对于生物反应器的换热系统的设计计算，应充分考虑不同的菌种、不同的代谢条件，其产生的热负荷是不同的，那么，生物反应器的有效传热面积也不相同，甚至差别是很大的，否则，满足不了工艺的要求，而且，很可能…… 2.O搅拌热
298
298
298298
298
298
298
由于机械搅拌通气式发酵罐在运行过程中，搅拌浆作比较剧烈
的运动，造成液体之间、液体与搅拌浆等设备之间的摩擦，会产生大量的热量，可用下式计算： O搅拌热 = P×3601
式中:P ——搅拌浆的搅拌功率（kw）
3061——机械能专为热能的热功当量（kw.h） 3. O蒸发热
生物反应器在运行过程中，空气进入反应器与发酵液进行长时
间的气、液接触，除部分的氧被利用以外，大部分的气体（称为尾气）仍旧排放出反应器，由于尾气在与发酵液接触的过程中实际上在进行质量的传递，使进入的空气的湿度增加，水分随着尾气一起被排除，同时伴随热量传递，这一部分热量，称之为蒸发热。计算如下：
O蒸发热 = G (I出 – I进)
式中：G—空气的流量（Kg/h）
I出 、 I进 分别表示尾气、进气得热焓(kJ/Kg) 4.O辐谢热
辐谢热：指反应器内部的温度与反应器的环境温度的差别造成的热量传递。
通常按照O发酵热的5%---10%计算。 二、温度对发酵的影响 1.从酶促反应动力学方面
微生物的发酵过程实际上就是一个酶促反应的过程，根据酶促反应动力学，温度越高，酶促反应速度越快，菌体增殖、产物
合成的时间均可提前；但是温度越高，酶越易失活，表现在外观上，则是菌体易衰老，整个发酵周期缩短，影响发酵的最终产量，对于发酵是不利的。
微生物的生长速率的变化，可以使用下式描述：
dx/dt == μ- α*X
式中：μ——菌体的比生长速率
α——菌体的比死亡速率
因此，dx/dt是菌体生长和死亡平衡和结果。
α、μ与温度有关，可以使用阿累尼乌斯公式描述： μ== Aμ*exp[-Eμ/RT] α== Aα*exp[-Eα/RT] 式中： Aμ、 Aα——常数
Eμ 、Eα——分别是菌体生长和死亡的活化能
通常，生长的活化能Eμ= 25—32×104KJ/mol 死亡的活化能Eα== 104—122×104KJ/mol
因此，温度对死亡的影响要远比对生长的影响要大，从这个意义上讲，在发酵过程中，对于温度的控制应该是严格的，不能任意的、没有任何根据的升温，否则，可能导致菌体过早的衰老，发酵周期缩短，产物产量、产率下降。 2.从温度对发酵液的性质的影响方面
温度影响了发酵液的许多性质，包括：营养物质的电离状态、发酵液的粘度等。发酵液粘度的改变，影响了发酵过程中各种物质的传递，特别是氧和热量 的传递，进而影响了微生物的发酵。研究表明，以蔗糖为底物的Xanthan的发酵过程中，当Xanthan 的浓度达到24g/L后，由于Xanthan的高粘度的性质，使得发酵液的温差可以达到15℃以上，严重的影响了黄源胶产生菌的代谢和
生理活动。
3.温度对菌体代谢调节机制的影响
近几年来的研究表明，温度对于菌体的调节机制有着密切的影响。
例如：当温度20℃以下时，AA合成的最终产物对其合成链的第一个酶的反馈抑制作用比在正常的发酵温度37℃的条件下更大。
根据这个原理，有人提出对于次级代谢发酵，当菌体生长完成后，可以考虑降低发酵液的温度以强化上述这种抑制作用，使得菌体的AA合成受阻，进而抑制蛋白质的合成，菌体生长停止，有利于促进菌体由生长型到产物及类型的转变，当菌体完成了这种转变后，再升高发酵液的温度。当然，工业化的应用存在一定的问题，就是温度的升、降对于大体积的发酵也难以实现……。 三、温度的控制
CP：控制周期 SV：设定值 PV：显示值 NSB：不灵敏区 MS：最小动作时间
§5-3 氧传递与控制
供氧对于微生物的液体深层培养是必需的，也是目前各种生物
反应器设计的主要的参数之一。由于氧难溶于水的特性，决定了氧的供给成为提高微生物培养密度、提高单位体积发酵液产量的限制性因子。 一、氧对发酵的影响
氧对微生物发酵的影响是多方面的，不同的菌系、不同的发酵阶段对于氧的要求也不相同，氧对其的影响也不相同，具体
的讲：
1.影响了菌系的酶活性
在微生物的代谢过程中，有许多的催化脱氢氧化反应的酶都是以NAD(P)为辅酶的，NAD(P)的浓度是保证酶活力的基础。NAD(P)作为H的受体，脱氢后成为还原兴的NAD(P)H，NAD(P)H只有在有氧的的条件下可以及时地通过呼吸链被氧化（个别情况，NAD(P)H可以参入还原反应，比如：α—KGA的还原氨基化……），生成氧化性的NAD(P)，NAD(P)作为辅酶重新参入脱氢反应，一旦，发酵液中的氧的浓度不够，则与NAD(P)相关的酶促反应停止，那么，NAD(P)的浓度……。 2.氧的存在影响了代谢途径
氧存在是TCA循环能够进行的基础，缺氧必然导致丙酮酸的积累（丙酮酸的氧化脱羧强烈徐扬），丙酮酸的积累，导致乳酸的形成；其结果是发酵液的PH值不降；通常，当Broth的溶氧急剧下降时，意味着菌体进入了对数生长期或产物合成期，这时，往往伴随的是发酵液的PH值下降。
虽然，大多是情况下，氧可能成为发酵的限制性因子，但是，在有的情况下，也并不是溶氧越高越好。
1在GA发酵的GA合成期（中后期）○，过量的供氧会使NADPH进入
呼吸链被氧化，减少了NADPH的浓度，而NADPH与а-KGA的还原氨基化是相偶联的，这必然会影响а-KGA GA的合成。
2在地衣芽孢杆菌生产耐高温а-Amylase的发酵过程中，当菌体○
进入了а-Amylase的合成期后，发酵液的[DO]值可以回升到100%，这时，可以适当的降低Broth中的溶氧浓度，可以减缓菌体的PH
回升速度，延长发酵周期，提高发酵液的酶活力。这种情况，更深层次的原因尚需进一步研究（代谢机制）。 二、氧传递动力学： 1、氧传递的双膜理论：
1溶氧过程存在一个界面，这个界面的厚度可以忽略不计。在这○
个界面上，气相中氧的分压与溶于液相中氧的浓度呈平衡关系，既Pi与Ci呈平衡关系，符合亨利定律：Ci= K *Pi
2传质过程是一个稳定的过程，各点氧的浓度不是时间的函数。 ○
3气膜、液膜都以层流状态存在。 ○
气膜 液膜 气相主流 液相主流 传 质 方 向
在以上三个条件的基础上，则有下列氧传递方程： dc/dt = kLa×(c* - c)
式中：dc/dt——溶氧速率，mol/m3.h kLa——体积溶氧系数，1/h
c*——与气相中氧的分压呈平衡的液相中的氧的浓度，也
就是一定体系下的液相中的最大的溶氧浓度，mol/ m3
c——液相中氧的实际浓度，mol/ m3
上式是以(c* - c)为传质动力的氧传递方程式，也可以写成
以（P*-P）为推动力的氧传递方程式： dc/dt = kLa×（P*-P）
以双膜理论为基础，对氧传递过程中的现象进行定量的描述，
其目的在于：正确认识氧传递过程中的本质，以提高传氧效率。实际上，在微生物发酵过程中，以双膜理论为基础的氧的传递方程式没有太大的计算意义，因为方程式中的kLa是一个变值，研究表明，kLa不但与反应器的设计参数（结构参数）（D/T、涡轮形式、N、Pg/v）的有关，还与发酵液的性质有关，而发酵液的粘度、浓度随着发酵的进行是不断的变化的，因此，kLa的值也在不断的变化，从这个意义上讲，研究氧传递动力学方程，其主要目的在于正确的认识氧传递过程中的各种阻力，以提高传氧效率。 2.氧传递过程中的阻力
上式中的溶氧速率dc/dt，实际上是发酵液中氧的实际浓度，更准确的说是供氧与耗氧的动态平衡，分析氧传递的阻力，可以分为供氧与耗氧两个方面：
供氧方面的阻力： 气体主流到气膜的阻力k1-1
克服气膜的阻力，k2-1 通过气、液界面 气体克服液膜的阻力，k3-1 进入液体主流 气体在液相主流中的传递阻力，k4-1
耗氧方面： 细胞膜的阻力：k5-1
细胞内氧与呼吸酶反应的阻力：k6-1
整个阻力：k-1 == k1-1 + k2-1 + k3-1 + k5-1 + k6-1
前4项，与发酵液的性质（组成、浓度）、操作运行条件有关，显然阻力越少，溶氧越好。
后2项，与菌种的生理特性和种类有关，降低这一部分阻力，实际上就是提高了(c* - c)，即提高了溶氧传递推动力。
下边，结合氧传递动力学方程和上述氧传递过程中的各项阻力，来分析提高氧传递效率的方法。 三、提高氧传递效率的途径
从氧传递动力学方程式，可以看出：提高氧传递效率可以从两个方面研究： kLa和（c* - c) 1.提高kLa
kLa与操作参数之间的关系，可以使用下式表示出来： kLa = f(N Q μ Vs ……) （1）搅拌 目的：（定性的描述）
打碎气流，形成小气泡，增加气液接触面积，以利于……
使液体形成涡流，增加气泡在液体中的滞留时间
定量的讲： kLa ∝ (Pg/V)α ×Vsв
Pg ∝ N2.46
可见，提高N可以有效的提高kLa，从而增加发酵液中的溶氧浓度。 在耐高温α-淀粉酶的发酵过程中，当菌体进入对数生长期时，发酵液的溶氧浓度…
但是，高转速也有不利的方面：
能耗较高，生产成本高，黄源胶发酵……
形成漩涡，降低气液间的混合效果，起不到应有的作用
增加液体的湍流程度，减少气泡周围的液膜阻力k3-1，
减少氧在液体主流中的传递阻力k4-1 对于真菌、食用菌等易结团现象，降低细胞膜的表面阻
力，降低细胞周围代谢物的浓度
对于某些微生物，高转速产生的高剪切力，不利于菌
体的生长
对于高粘度物系的发酵，搅拌产生的影响是多方面的： a 对传热的影响
高粘度的物系发酵的发酵和其他发酵一样，发酵过程中有大量的热量产生，由于物料的高粘性使得热量的传递非常困难，例如，Xanthan的发酵，随着发酵液中的xanthan浓度的增加，发酵液的粘度也越来越大，当发酵进行到40小时时，发酵液中Xanthan的浓度可达到22g/L，严重的影响了热量的传递，对于一个6L的生物反应器，反应器中心的发酵液的温度与内壁发酵液的温度之差可达到15℃以上，这个温差严重的影响了发酵的正常进行，
b 搅拌对气液混合的影响
不同的搅拌速率对
于气
液混合也会带来比较显著的影响。以黄源胶发酵为例，当发酵液中的还原胶的含量较高时，发酵液的粘度很高，此时搅拌转速越大则气穴体积（Cavern Volume）越大。为了更好的说明这一问题可以引用一个概念来表示——气穴体积/发酵液中体积（Cv/Tv），如图1所示，Cv/Tv越少则说明基本上处于停止不动的发酵液的体积越大，这一部分发酵液其内部氧的传递和其他营养物质的交换
很少，甚至可以说根本就不存在质量的传递，这必然导致细胞活力的下降甚至细胞死亡，那么这一部分发酵液中黄原胶的浓度很低而且其分子量分布也很宽。A.Amanullah 和 B.Tuttiett[13]在6L的玻璃生物反应器内系统的研究了这一问题，研究表明：当发酵液的黄原胶浓度在18g/l时，在搅拌速率分别为500转/和1000转/分的条件下，其Cv/Tv值基本上相同，近似于100%。但是当发酵液的黄原胶浓度的增加20g/l时，前者，其Cv/Tv值下降到77%，而当发酵液的黄原胶浓度的增加到26g/l时，其Cv/Tv值进一步下降，只有35%；对于搅拌转速为1000转/分的发酵过程，当发酵液的黄原胶为24g/l时，其Cv/Tv值下降到88%，而当黄原胶的浓度达到32g/l时，其Cv/Tv值随之进一步下降到80%。上述研究结果说明，搅拌转速对黄原胶的发酵有着重要的影响，而且这种影响随着发酵液中黄原胶浓度的增加将变得更为严重。 （2）Vs——空气流速
由公式kLa ∝ (Pg/V) ×Vs可知，提高Vs即提高通风量Q也可以有效的提高kLa，但不能够无限的增加通风量,研究表明，当通风量增加到一定的量后，(Pg/V)会随着Q的增加而下降，也就是说单位体积发酵液所拥有的搅拌功率会下降，不但不能提高kLa，甚至会造成kLa值的下降。
通风量Q与搅拌功率Pg的关系，可以使用迈凯尔公式描述： P = ( P0*N*Di/Q0.08)0.39
α
в
式中：P0——不通风时的搅拌功率W
P0 == N3*(Di)5 *ρ
增加Q除了上述缺点外，还存在以下不足之处：
挥发性中间产物有一定量的损失，
搅拌浆过载，达不到良好的混合效果。
发酵液水分蒸发加大，增加了发酵液的粘度。
造成逃液，增加phage的感染机会。
通常，Vs = 150cm
2.提高（c* - c)，即氧传递动力
（1）c*，受到体系的温度、发酵液的浓度、粘度、pH值等因素的
影响，改变c*是没有太大的余地的。因为，发酵温度、浓度等严格的受到菌体生长和发酵工艺的限制。 （2）提高罐压
Pi增加则与之平衡的Ci也会增加，对提高（c* - c)是有一
定作用的。
缺点：气泡体积减少，不利于气、液的接触。
有害气体（CO2）浓度也在增加，同样不利于M的代谢。 微生物的生长也会对罐压提取要求。（≦0.1MPa） (3)利用纯氧，可以提高（c* - c) 缺点：价格较高 易引起爆炸
局部氧的浓度高，引起M的中毒（SH蛋白质的氧化） 可见，提高KLa最有效的方法是提高N与Vs，并协调两者
之间的关系，其他方法效果不大，且受限制较多。
§5-4 发酵过程中PH值的变化及控制
一、 pH值对菌体生长和产物合成的影响
1. pH值影响到了酶的活性，不同的酶有其最适合的pH值，当菌
体中的酶系处于不适合的pH值环境时，必然影响到其代谢活
动。
2.pH值影响了菌体细胞膜的带电状态，从而影响了细胞膜的渗透
性，必然就会影响营养物质的吸收与代谢产物的排泄。 3.pH值影响Medium中的营养成份和中间性代谢产物的电离状态，
从而影响了M对这些物质的正常利用。
4.pH值不同，其菌体代谢途径也会发生变化，代谢产物也不同。 例如：在GA发酵过程中，当pH›5.5时，谷氨酰胺的合成加
强，产物中有GA，还有GA→谷氨跣胺
例如：在黑曲霉的柠檬酸发酵过程中，pH=2-3时，菌体合成
并分泌柠檬酸，而当pH在中性时，（PH=6-7）则合成积累草酸。
5.pH对细胞形态的影响
这实际上是pH值对细胞生长和代谢途径影响的外部（宏
观）表现，在GA发酵过程中，pH值不同，代谢途径不同，菌体形态不同。
在青霉素发酵过程中，pH≧6.0时，菌丝体缩短，而pH≧7.0时，膨胀的菌丝体明显的增加。 二、影响发酵液pH值变化的因素
菌体在发酵过程中pH的变化与其生理代谢有着直接的关
系，不同的菌系在发酵过程中pH的变化规律是不同的，但是导致其变化的因素基本相同，如下： 1.酸性产物的积累
因其酸性产物积累的原因：
（1）降糖速度过快，特别是MEP速度过快，打破了EMP:TCA之间的平衡，导致丙酮酸，使得丙酮酸的代谢转向了，
丙酮酸 乳酸 (高浓度的磷酸盐有……) （2）供氧不足
在对数生长期，或者产物合成期，由于菌体强烈的需氧，导致发酵液的[DO]值急剧下降，使得有氧氧化途径受阻，使乳酸等酸性物质积累： 丙酮酸 乙酰辅酶A ，强烈需氧，否则，……
琥珀酸 ？ ，强烈需氧，否则，…… 2.生理酸性物质被利用，引起pH的下降
生理酸性物质：(NH4)2SO4 , (NH4)2HPO4 , NH4H2PO4 ,KH2PO4 K2HPO4
当NH4+被利用后，引起pH的下降；
当PO43-被利用或者电离后，可以引起发酵液的pH的下降。 3.代谢产物的积累，导致pH的下降
酸性产物：柠檬酸、某些酸性氨基酸、CO2(溶解在发酵液中……) 4.杂菌的感染，引起pH的下降或者上升
醋酸杆菌、乳酸杆菌、野生酵母等
5.发酵后期，菌体自溶造成pH的上升
发酵液的pH的上升，特别是发酵后期，大部分的原因是由于菌体死亡并产生菌体自溶造成的。
例如：通过研究苏云金芽孢杆菌Bt发酵过程中pH值、NH4+、AA
的浓度三者之间的关系发现，发酵中期，pH值上升是由于菌体从以碳素代谢为主的生长期转为以氮素代谢为主产物合成期（伴胞晶体的合成），这个时期，NH4+的浓度变化非常活跃；后期随着代谢的减慢或者停止，NH4+浓度变
化仍然很活跃，而且发酵液的pH值也继续上升，通过镜检发现，发酵液的菌体浓度明显下降，且有大量的菌体碎片存在。
大量的研究表明，发酵后期发酵液的pH值的上升确实是由于菌体死亡并伴随着菌体自溶造成的。
6.培养基在设计、配制过程中，氮源过高造成pH值上升
当菌体生长到一定的阶段后，由于自身分泌的胞外蛋酶，对培养基中的蛋白质的水解，使得大量的AA产生，这些大量的AA使得菌体本身的AA的合成受阻，则NH4+的浓度增加，导致发酵液的pH值的上升。 三、pH值的检测与控制
目前，现代化的生产企业大部分是采用pH值的在线（on
line ）检测、控制方式，其核心部件是pH值检测的电极，这种电极不同于普通的pH值检测电极，其基本要求是：耐高温、经受120℃以上高温、60分钟的处理； 需要有压力补偿系统，因为：…… pH值的检测控制方法如下： 1.连续自动的控制方法 2.脉冲式的控制方法
例如：在GA发酵过程中，向发酵液中流加氨水、尿素，其pH值的变化如图所示：
3.培养基的配制中使用缓冲性物质
许多微生物的发酵培养基中都使用一定量的缓冲性物质，以减缓发酵液在发酵过程pH值的变化，常用的缓冲性物质有：CaCO3，柠檬酸盐、磷酸盐等。其中CaCO3在许多发酵过程中都使用，例如：黄源胶、Bt等；而后者，构成一个缓冲性体系应用于培养基中，
在地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶（thermostable amalase）发酵过程中使用。
衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶（thermostable amalase）培养基使用下列成分：
柠檬酸盐：0.2% ； NaH2PO4 1.4% ； Na2HPO4 0.6% 则可以有效的控制发酵过程中pH值的变化，起到调节发酵液pH值的作用。 需要指出的是：
缓冲性物质在灭菌的过程中易与金属离子、大分子物质形成沉淀，在这种情况下，可以单独对这类物质进行灭菌，灭菌完成后，可以无菌操作加于到发酵罐中。
§5-5 泡沫的消长规律及其控制
一、泡沫的危害
在深层液体发酵过程中，由于通风和搅拌的原因，加之培养基中的糖、蛋白质和代谢产物等稳定泡沫的物质存在，使发酵过程中产生一定的泡沫，这是正常现象。但是，如果泡沫过多，特别是通风量较大的发酵，在菌体生长期和产物合成期，泡沫更为严重，给发酵带来许多不利的影响，如下： 1.降低了发酵罐的装料系数
正常的发酵罐装料系数在60—70%，余下的空间就是为了容纳泡沫，这一个空间也只能够容纳培养基中10%的发泡物质产生的泡沫。
对于许多酶制剂的发酵，发酵罐的装料系数更少，只有50%左右，降低了发酵罐的装料系数，就意味着设备利用率降低，则生产成本……
2.增加了发酵过程中微生物群体的均一性
由于泡沫造成的液位的变动，以及处于不同的生长状态的微生物随着泡沫的飘浮可能粘在罐壁上，是菌体的生长环境发生了变化，有的分化、有的瓦解，影响了菌群的整体性，不利于发酵的控制。
3.增加了感染phage的机会
大量的泡沫可以从搅拌轴轴封处逃逸，也可随着尾气一起排出到大气中，这就使得发酵罐的环境、工厂周围有了大量的活菌体，这些活的菌体存在于环境中，就增加了环境中的phage的浓度，根据对数残留定律，……机会。
4.大量的泡沫出现，必然引起逃液，逃液就意味着发酵液的损失，这不断增加了感染phage的机会，而且也降低了产率。 5.泡沫过多，引起搅拌浆的空转，降低了搅拌功率，……？ 二、泡沫的性质
1.定义：泡沫是指气体分散在少量液体中的一种体系。
在这个体系中，分散相是：气体 连续相是：液体 2.种类
按照泡沫存在的状态可分为两种：
存在于发酵液上部的：这种泡沫通常产生于发酵前期，特点是，
泡沫与液体主流存在一个明显的界面，易破碎，泡沫体积较大
存在于发酵液中的：有人称之为：流态泡沫（fluid foam） 特点：分散的均匀，与液体主流没有明显
的分界面，存在于发酵液中，比较稳定，
很难清除。
三、影响泡沫的因素
发酵过程泡沫的产生是有一定的规律，其主要影响因素如下： 1.与通风量、搅拌转速有关
通风量越大，泡沫越多；搅拌转速越大，泡沫越多。 2.培养基的成分
发泡物质：玉米浆、蛋白胨、花生粉、豆粕粉、黄豆粉、酵母粉、糖
蜜等
泡沫的稳定物质：glucose,起泡性较差，但是它可以增加发酵液的粘
度，稳定泡沫的存在。
3.与灭菌的操作有关
灭菌过程中，灭菌的强度越大，其发酵液中的泡沫越多；这可能是由于灭菌的过程中，高温使得培养基中的糖、氨基酸形成了大量的类黑精，或者是形成了：5’—羟甲基糠醛； 4.泡沫与菌体的生长代谢有关
通常，在发酵初期，由于培养基中的大量的发泡物质的存在，使得泡沫较多，但这时的泡沫大，易破碎；随着菌体的大量的增殖，以及大量的发泡物质被消耗，发酵过程中有一段时间泡沫很少；当菌体进入对数生长期后，由于菌体呼吸强度的增加，泡沫越来越多；当菌体进入产物合成期后，发酵液的泡沫仍然继续增加，这主要是由于菌体合成的产物增加了发酵液的粘度；发酵后期，由于大量的菌体的死亡以及死亡菌体细胞的菌体自溶，使得发酵液中的大分子蛋白质浓度增加，泡沫更为严重。 四、化学消泡
泡沫的形成是正常的，但在发酵过程中他又存在一定的危害性，因此需要进行控制。控制泡沫的方法有化学消泡和机械消泡两种方法。分述之：
所谓化学消泡，就是指：向发酵液中流加一定量的消泡剂，利用消泡剂的特殊性质消除掉泡沫的方法，首先讨论一下消泡机理： 1.消泡机理
在发酵过程中，向发酵液中添加消泡剂，可以有效的控制泡沫的形成，其机理因消泡剂的种类不同而异，通常有以下几种：
（1）当泡沫表面存在极性的双电层时，可以加一种带有相反电荷的表面活性剂，消除这种双电层，以降低泡沫的机械强度。
（2）当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可以某些 分子内聚力 较少的物质，以降低液膜的表面粘度，从而使泡沫的液膜中的液体流失，导致泡沫破裂，达到消泡的目的。 2.消泡剂选择的原则
消泡剂选择是一个比较重要的任务，选择一个良好的消泡剂，既可以有效地把发酵过程中的泡沫消除，又可以降低原材料成本。泡沫在发酵产品中的成本比例较高：
GA 发酵：5Kg/吨*GA , 价格：30元/Kg
年产10000吨味精的企业：消泡剂的成本：150万元
好的消泡剂应具备以下几个条件：
（0）对发酵过程中的微生物的生长和代谢无副作用，对人、动物无毒性。（产品人用，母液用于饲料的生产）（1）能够迅速的消泡，对泡沫的控制持久性好。（2）高温灭菌不变性，在高温灭菌的温度下，对设备无腐蚀，也不产生腐蚀性的物质。发酵过程中流加的消泡剂需要先灭菌后流加,培养基中先要加一部分。（3）对产品的后述操作不产生不利的影响。（4）不干扰发酵过程中的分析系统的正常工作，DO、PH等（5）对氧的传递不产生不利的影响。（6）来源丰富，价格低廉。（7）分散性还好，有利于泡沫的控制。
三、消泡剂的类型
1.天然油脂类主要有：玉米油、豆油、棉籽油、花生油等
优点：价格便宜，来源较广泛，在中间加入后可以作为微生物的C原使用。 缺点：不能够一次性的加入的过多，否则，各种油脂会被脂肪酸酶分解成各
种脂肪酸，造成发酵液的PH值的下降。
油脂易氧化，氧化了的油脂对微生物的生长和代谢可能带来抑制作
用。
2.聚醚类：生产上应用较多的是：聚氧乙烯氧丙烯甘油，又成为泡敌（GPE），其使用量在0.3-0.35%，消泡能力为天然油脂的10倍以上。聚氧丙烯（GP)也是一种消泡剂，其与环氧乙烷加成则生成聚氧乙烯氧丙烯（GPE）泡敌，前者，具有良好的抑跑能力，后者，具有良好的消泡能力。在实际生产中，可以考虑两者共同使用。
3.硅酮类：聚甲基硅氧烷及其衍生物。
分子式：(CH3)3SiO[(CH3)2Si]nSi(CH3)3
为无色液体，不溶于水，试验表明，适合于微碱性的细菌、放线菌的发酵，对于发酵液的pH值为5左右的霉菌类的发酵，其消泡能力很差。
尽管消泡剂的种类很多，但是，我所了解的大都是使用泡敌为消泡剂。例如：苏云金杆菌的Bt发酵； GA产生菌的GA发酵；
地衣芽孢杆菌的thermostabl α-Amylase的生产等。 应该说对于特定的菌种和Medium，应该根据其Medium的性质和菌体代谢特点，研究出一种特定的消泡剂。目前，在微生物的发酵领域，尚没有做到这一点，不久的将来，专一性很强的消泡有可能问世。
五、机械消泡：
应该说，无论是化学消泡或机械消泡都是一种被动式的泡沫消除方式。
机械消泡无论是从发酵产品的质量上，还是从其使用方法上，以及对发酵过程中微生物代谢的影响上，都要比化学消泡优越。
国内外的消泡方法是有差别的：国外，以机械消泡为主，辅以化学消泡。国内，目前以化学消泡为主，辅以机械消泡。国内也有机械消泡装置安装在发酵罐内，但是由于国内的生物反应器的结构不同于国外，只不过是在搅拌轴上安装有一个消泡浆，其作用是非常有限的。 1.离心式消泡： 2.一种新型的消泡系统：
§5-6基因工程菌的培养与发酵
一、基因工程菌培养的准则：
关于基因工程菌的社会问题，首当其冲的应是人们普遍关注的基因工程菌的潜在危害。经过重组的菌体和质粒，一旦用于工业化生产，就不可避免地进入了自然界（随着尾气、发酵液、出样等操作）。 1.基因工程菌培养的实验室准则
这些菌体可以间接的危害人体健康：使治疗药物失效、污染环境等。
为此，美日等国先后制定了有关DNA重组的实验室准则，确定了在实验室规模上DNA重组实验的基本原则。这些准则参照了病原微生物防治的措施，提
出了两种封密的方法――物理密封方法和生物密封方法。 （1）物理密封方法：
就是重组菌密封在培养设备内，以防止向自然界中扩散。
可分为P1、P2、P3、P4四个级别，数字越大，说明其密封程度越高。 目前，SARS病毒的研究，就是在P3实验室内进行的。 （2）生物密封方法：
在重组DAN的设计时，选择的宿主（host）载体 需要在特殊的条件下才能生长。分为：B1、B2，B2级别是最为严格的。 2.基因工程菌工业化培养的准则
对于基因工程菌工业化培养的准则，有两个标准： LS---1和LS—2，其要点是：
（1）培养设备能够防止重组菌外漏，可以在密封的状态下，对设备进行灭菌。
（2）培养装置的尾气需要经过除菌或灭菌后方能够排除到大气中。 （3）泡沫过多的培养过程，要求有专用的泡沫收集装置。
（4）发酵液的后处理，包括：菌体分离、破碎等工艺，须在密闭的设备内或者安全柜内进行。 二、基因工程菌培养的条件
从本质上讲，基因工程菌的培养与普通微生物培养因该是以相同的，但由于基因工程菌本身的特点，也给他的培养带来了特殊的要求。
总体上讲，基因工程菌的培养除了应遵守普通微生物培养的规律外，欢迎考虑以下几个问题： （1）质粒的稳定性
外源基因接合到质粒上，以质粒作为外源基因的载体，融合到宿主（host）细胞内，构成了基因工程菌。这种菌在增殖的过程中，发生质粒丢失的可能性是非常大的，一旦质粒丢失，工程菌就恢复到了原来的状态，也就失去了培养意义。
（2）蛋白质的合成——基因的表达
基因工程菌培养的目的在于使外源基因所翻译、转录的蛋白质得以合成，其蛋白质是目的产物。在基因工程菌的培养过程中，由于外界条件的影响，有时能够得到高浓度的菌体培养液，但是目的产物的浓度却并不高，这就需要研究基因工程菌培养过程中的培养条件，优化气培养工艺。
下边分述与基因工程菌培养有关的几个问题： 1.培养基的影响
培养基的组成既要考虑提高工程菌的生长速率，又要保持重组质粒的稳定性，还要使质粒中的外源基因得以高效率的表达。
常用的C源： Glucose、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。不同的C源影响是不同的。Glucose、甘油是使用率较高的C源。两者菌体的比生长速率、呼吸强度相差不大，但是，以甘油为C源的培养基，菌体的得率较大；而以Glucose为C源的培养基，发酵液中的副产物则较多 ？。
常用的N源：
酵母浸出物、蛋白胨、酪蛋白水解液、玉米浆、氨水、硫酸铵、氯化铵等。
其中，酪蛋白水解液有利于产物的合成与分泌；其原因可能是其中的AA对于typ启动子控制的基因表达有影响。
无机磷对工程菌培养的影响： 无机磷对于EMP、HMP等途径都有促进作用，对于大分子物质（DNA、RNA、Pr）的合成ATP的生成，都有促进作用，但有人研究表明：在较低的磷酸盐浓度下，尽管菌体浓度较低，但是最终的目的产物的产率却是很高。
进一步的研究证明：控制无机磷酸盐在培养基中的浓度，当菌体生长到一定的密度后，磷酸盐被消耗到极低的浓度，目的产物才得以合成，也就是说，目的蛋白质的合成才能够实现。
通常控制磷酸盐的浓度：培养基中的开始浓度：0.015mol/L 低，影响菌体的生长； 高，外源基因能以表达。
2.接种量 对于普通微生物的培养，选择接种量的大少通常考虑的是设备的能力，但对于基因工程菌，考虑更多的是对基因工程菌培养以及外源基因的表达的影响。
接种量大：可以缩短发酵周期，减少染菌的机会；但是菌体生长过快，代谢
产物积累过多，对菌体后期的生长有抑制作用。
接种量少：延迟生长，整个发酵周期长，不利于外源基因的表达。 接种量为：10% 3.发酵温度的影响
温度对基因工程菌培养的影响是多方面的，温度对基因表达和调控的作用
发生在：复制、转录、翻译三个方面。
在复制水平上：可以通过调控复制，来改变基因的拷贝数，从而影响基因
的表达。
在转录水平上：温度通过对RNA聚合酶的作用，来调控基因的表达。
在翻译水平上： 温度可以通过对mRNA的降解作用，来调控基因的表达。 温度还影响目的产物（蛋白质）的表达形式：
例如：重组人生长激素的发酵： 30℃培养，目的产物（激素是可溶性的； 37℃
培养，目的产物形成包含体。
包含体：通常，低温有利于重组菌质粒的稳定遗传。
4.溶氧对……
DO值对于工程菌培养的影响与其他微生物培养一样，是一个重要的参数，对菌体的生长、产物的合成都有着重要的影响。
在菌体生长期：过低的DO值，影响菌体的生长，成为菌体生长的限制性
因子。
在产物合成期：只有，DO值在40%以上时，才有利于外源基因的表达。 例如：利用工程菌Ecoli.W3100/PGM—CSZ生产巨嗜细胞集落刺激因子，如果，发酵液的DO值低于20%，则会产生大量的杂蛋白，影响产物的合成与分离提出。
三、基因工程菌的培养设备
体积：20——70L，总体上满足前述基因工程菌的培养准则，特点： 1.
尾气系统2.出样系统
本章思考题：
1.基本概念：
发酵热、生物热、发酵动力学类型、生长相关性发酵、混合生长相关性发酵、非生长相关性发酵、微生物的比生长速率、搅拌轴功率、氧传递动力学方程、氧传递的双膜理论、泡沫、化学消泡与机械消泡
2.计算酵母菌在厌氧条件下代谢葡萄糖的发酵热？计算在好氧条件下的发酵热？两者比较说明什么？
3.pH值对微生物生长的影响主要表现在那几个方面？ 4.我国机械消泡不能起主导作用的原因是什么？ 5.说明发酵过程中泡沫的消长规律？ 6.影响泡沫稳定的因素有哪些？
7.选择化学消泡剂的原则是什么？化学消泡主要有什么缺点？ 8.高粘性物系发酵过程中，搅拌产生的影响有哪些？
9.以谷氨酸发酵过程中pH值的变化规律为例，说明为什么pH值的变化是反应过程中菌体生长和产物合成的综合性指标？
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