(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110463686 A(43)申请公布日 2019.11.19
(21)申请号 201910611073.7(22)申请日 2019.07.08
(71)申请人 深圳市华晨阳科技有限公司
地址 518104 广东省深圳市宝安区沙井街
道洪田上南东路恒昌荣高新产业园4号厂房8楼A区(72)发明人 巩赞华 巩赞博 巩赞斌 张金银
黄咏华 (74)专利代理机构 西安中科汇知识产权代理有
限公司 61254
代理人 汪重庆(51)Int.Cl.
A01N 1/02(2006.01)
权利要求书3页 说明书8页
(54)发明名称
一种可以长时间有效保存细胞的细胞保存液
(57)摘要
本发明公开了一种可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其组成如下：磷酸氢二钠0.1-3g，磷酸二氢钾0.1-4.1g，氯化钾0.01-2.2g，氯化钠0.6-1g，氯化钙0.001-0.01g，冰醋酸0.1-7g，乙二胺四乙酸1-16g，三羟甲基氨基甲烷0.001-0.003g，蔗糖0.1-0.24g，表面活性剂0.98-2.6g，去离子水定容至100mL，pH6.8-7.6。本发明的有益之处在于：本发明提供的细胞保存液可以在较长的时间内维持细胞的活性，因此可以长时间有效保存细胞；采用本发明提供的细胞保存液保存细胞时，在较长的保存时间下，细胞保存液仍可以抑制微生物滋生，避免细胞受到微生物的破坏。
CN 110463686 ACN 110463686 A
权 利 要 求 书
1/3页
1.一种可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的组成如下：
2.根据权利要求1所述的可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其特征在于，所述表面活性剂选用的是吐温20。
3.根据权利要求1所述的可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其特征在于，所述表面活性剂选用的是十二烷基硫酸钠。
4.根据权利要求1所述的可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的成分如下：
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CN 110463686 A
权 利 要 求 书
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其中，表面活性剂选用的是吐温20。
5.根据权利要求1所述的可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的成分如下：
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CN 110463686 A
权 利 要 求 书
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其中，表面活性剂选用的是十二烷基硫酸钠。
6.根据权利要求1所述的可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其特征在于，所述细胞保存液的成分如下：
其中，表面活性剂选用的是吐温20。
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CN 110463686 A
说 明 书
一种可以长时间有效保存细胞的细胞保存液
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技术领域
[0001]本发明涉及一种细胞保存液，具体涉及一种可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，属于医学生物技术领域。背景技术
[0002]细胞是生命最基本的单位，在很多方面都具有应用价值。对于细胞及细胞制品，与普通的生物制品和药品不同的是：需要维持细胞活性，而维持细胞活性是一个极大的挑战。[0003]生理盐水在临床应用上具有安全并且方便的特点，但是细胞在生理盐水中活性下降的速度非常快，在生理盐水中保存到第10h的时候，细胞的活性丧失就达到30％之多。可见，生理盐水只适合细胞短暂保存。[0004]目前，市面上已经有了一些细胞保存液，但是细胞在这些保存液中保存的时间一般在30d以内，虽然比在生理盐水中保存的时间长，但是与实际需求仍有较大差距。发明内容
[0005]为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可以长时间有效保存细胞的细胞保存液。
[0006]为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：[0007]一种可以长时间有效保存细胞的细胞保存液，其特征在于，前述细胞保存液的组成如下：
[0008]
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CN 110463686 A
说 明 书
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[0009]
[0010][0011]
优选地，前述表面活性剂选用的是吐温20或十二烷基硫酸钠。优选地，前述细胞保存液的成分如下：
[0012]
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说 明 书
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[0013]
[0014][0015]
其中，表面活性剂选用的是吐温20。活着，优选地，前述细胞保存液的成分如下：
[0016]
[0017][0018]
其中，表面活性剂选用的是十二烷基硫酸钠。或者，优选地，前述细胞保存液的成分如下：
[0019]
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CN 110463686 A
说 明 书
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[0020]
其中，表面活性剂选用的是吐温20。
[0022]本发明的有益之处在于：[0023](1)冰醋酸是抗微生物剂，对多种微生物(包括细菌、芽胞、病毒等)都有高效、快速的杀菌作用，所以本发明提供的细胞保存液能够防止细菌、芽胞、病毒等微生物滋生，使细胞不被破坏，从而可以长时间有效保存细胞；[0024](2)EDTA可抑制核酸酶的活性，防止核酸被酶降解，所以本发明提供的细胞保存液能防止核酸的降解；[0025](3)氯化钙、氯化钾、氯化钠为细胞提供营养离子，营养离子配合其它试剂一同使用，可以较好的维持细胞活性；[0026](4)三羟甲基氨基甲烷是缓冲对，合适的缓冲对能最大限度地保持细胞的形态完整，使之充分悬浮及分散；[0027](5)经试验，本发明提供的细胞保存液在常温下保存口腔细胞10h之后，口腔细胞的活性仍能达到99.9％以上，活性丧失得少，保存效果明显好于生理盐水；[0028](6)经试验，本发明提供的细胞保存液在常温下保存口腔细胞的时间可以延长到730d甚至更长，在保存至第730d时口腔细胞的活性仍能达到99.9％以上，活性丧失极少，保存效果明显优于现有的细胞保存液。
具体实施方式
[0029]以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。[0030]一、细胞保存液的组成[0031]磷酸氢二钠0.1-3g，磷酸二氢钾0.1-4.1g，氯化钾0.01-2.2g，氯化钠0.6-1g，氯化钙0.001-0.01g，冰醋酸0.1-7g，乙二胺四乙酸1-16g，三羟甲基氨基甲烷0.001-0.003g，蔗糖0.1-0.24g，表面活性剂0.98-2.6g，去离子水定容至100mL，pH6.8-7.6。[0032]表面活性剂：为非离子去污剂，可以是吐温20或十二烷基硫酸钠。
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[0021]
CN 110463686 A[0033]
说 明 书
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二、制备细胞保存液
[0034]按照下表配方准确称量各试剂，然后用少量去离子水将试剂溶解，之后再用去离子水定容至100mL，摇匀，最后调节溶液pH，即制备得到细胞保存液。
[0035]
[0036]
在本发明提供的细胞保存液中：[0038](1)磷酸氢二钠、磷酸二氢钾：溶液营养强化剂，可以用来增加溶液中离子强度，为细胞的保存提供足够的营养离子；[0039](2)氯化钙、氯化钾、氯化钠为细胞提供营养离子，营养离子配合其它试剂一同使用，可以较好的维持细胞活性；[0040](3)冰醋酸：抗微生物剂，通过氧化作用使酶失去活性，导致微生物死亡，并且冰醋酸具有酸的特性，在配制细胞保存液时，通过改变细胞内的酸碱度而损伤微生物，发挥高效、快速的杀菌作用，从而维持环境稳定，配合其它试剂一同使用，使得本发明提供的细胞保存液能够在常温下长期保持细胞中核酸的完整性，并且能够避免细菌等微生物的滋生；[0041](4)乙二胺四乙酸(EDTA)：螯合剂，可抑制核酸酶的活性，防止核酸被酶降解，有利
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[0037]
CN 110463686 A
说 明 书
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于核酸的稳定；[0042](5)三羟甲基氨基甲烷：缓冲液，能最大限度地保持细胞的形态完整，使之充分悬浮及分散；[0043](6)蔗糖：为细胞提供能量来源；[0044](7)吐温20和十二烷基硫酸钠：表面活性剂，具有较强的去污、渗透性能，能与膜蛋白的疏水部分结合，使膜蛋白与膜分离，从而得到核酸。[0045]二、验证保存效果[0046]1、细胞活性[0047]试验方法：用唾液采集器采集唾液，然后将唾液分别放于本发明提供的3组细胞保存液中，放于37℃和室温下保存，唾液与细胞保存液的体积比为1:1，然后在不同时间段取10uL混合液，放细胞计数器上统计活细胞的数目，统计结果如下：[0048](1)保存于第1组细胞保存液中
[0049]
[0050]
[0051][0052]
(2)保存于第2组细胞保存液中
37℃
1.4×1061.4×1061.4×1061.4×1061.4×106
10
4h12h48h30d90d室温1.4×1061.4×1061.4×1061.4×1061.4×106
CN 110463686 A
说 明 书
1.3999×1061.3999×1061.3985×1061.3985×106
7/8页
180d240d540d730d
[0053]
1.3998×1061.3998×1061.398×1061.398×106
(3)保存于第3组细胞保存液中
[0054]
[0055]
由此可见：本发明提供的细胞保存液可以在较长的时间内维持细胞的活性，因此
可以长时间有效保存细胞。[0057]2、保存液抑菌性[0058]试验方法：用唾液采集器采集唾液，然后将唾液分别放于本发明提供的3组细胞保存液中，唾液与细胞保存液的体积比为1:1，然后在不同时间段取10uL混合液，将混合液接种到营养琼脂平皿上培养观察是否长菌，用接种10uL唾液的营养琼脂平板做阳性对照，用空白未接种的营养琼脂平板做阴性对照，观察结果如下：
[0056][0059]
第1d第90d第180d第260d第540d第730d第1组无菌无菌无菌无菌无菌无菌第2组无菌无菌无菌无菌无菌无菌第3组无菌无菌无菌无菌无菌无菌阳性对照长菌长菌长菌长菌长菌长菌阴性对照无菌无菌无菌无菌无菌无菌[0060]由此可见：采用本发明提供的细胞保存液保存细胞时，在较长的保存时间下，细胞
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CN 110463686 A
说 明 书
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保存液仍可以抑制微生物滋生，避免细胞受到微生物的破坏。[0061]需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
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